Microbiome/根际原生生物是决定植物健康的关键因素

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题目：Rhizosphere protists are key determinants of plant health

根际原生生物是决定植物健康的关键因素

期刊：Microbiome  （2020.3）

IF：9.2

通讯作者：韦中

摘要：

      背景：植物健康受到根际微生物群的密切影响，根际微生物群是一个复杂的有机体组合，在植物生长过程中发生显著变化。然而，大多数根际微生物组的研究都集中在这种微生物组分上，特别是细菌和真菌。目前还不清楚其他微生物成分，特别是关键微生物群噬食性原生生物与植物健康的关系。在这里，我们研究了整个根际微生物组包括细菌、微生物真核生物（真菌和原生生物）以及功能性微生物代谢基因。我们研究了健康与发病番茄植株生长过程中的这些群落和功能基因。

      结果：我们发现原生生物最能预测植物生长过程中的病原菌动态。更具体地说，在植物生长发育过程中，健康植株和病株的嗜食原生物群落存在差异。这些嗜食菌的相对丰度与植物生长过程中的病原菌丰度呈负相关，表明捕食-食饵相互作用影响病原菌的表现。此外，嗜食性原生生物可能通过增强病原体抑制与减少病原体成功入侵有关的次级代谢物基因来改变细菌功能。

      结论：我们阐明了原生生物作 为与植物健康相关的微生物群功能自上而下控制者的重要性。我们认为，包括细菌和原生生物在内的整体微生物群观点为预测植物性能提供了最佳的下一步。

目的与意义：

       目前，了解微生物组在植物健康或疾病抑制中的作用的研究都集中在细菌，缺少一个完整的微生物组学观点来解释决定植物性能的主要微生物决定因素及其潜在的相互作用，特别是捕食者与食料菌的相互作用很少放进微生物组研究中。为了研究可能预测植物健康的潜在关键微生物群，在田间条件下使用了农业系统中的根箱系统种植了番茄植株（详见同期推送Science Advance，Initial soil microbiome composition and functioning predetermine future plant health）利用宏基因组学研究了微生物组分，包括细菌、真菌和原生生物，以及潜在的微生物功能。我们验证了这样一个假设，即根际微生物群中的原生生物而不是其他微生物群落最能预测病原体动态和植物健康。

实验设计：

（详见同期推送Science Advance，Initial soil microbiome composition and functioning predetermine future plant health）

图注：根箱采样系统原理图及实验设计。（A） 根箱由一个高136mm、直径110mm的三层圆筒组成。内层（根室）由50μm尼龙网制成，防止根进入中间层，外层由4 mm金属网制成，以支撑根箱。（B） 中间采样层由18个单独的尼龙网袋（150μm尼龙网；高度136 mm；宽度18至21 mm；厚度1至2 mm）组成，其中含有均匀和消毒的田间土壤。中间层尼龙网袋中的土壤与植物根系和根系分泌物有着密切的接触，可作为根际细菌群落的代表（这里是很多人疑惑的地方，译者认为由于本文没有在空间上对土壤分类，所以可以作为根际土的代表）。（C） 番茄幼苗移栽3周后，中心根室被植物根系密集定殖。（D） 在试验进行时（0周）采集初始土壤，在每个采样时间点（种植后3、4、5、6周）随机采集每个根箱的三个中层尼龙袋，对根际土壤进行采样。

图注：田间试验中根箱的放置及病害动态观察。（A） 本研究所用根箱的真实照片。（B） 田间试验结束时，将根箱 （用圆圈表示）放置在复制区和不同的疾病结果中（用不同颜色标记）。（C） 田间试验期间青枯病发病动态。发病率用番茄幼苗出现枯萎症状的百分比表示（平均值±标准差，N=3个小区，每个小区16株）。（D） 大田试验结束（第7周）时番茄茎冠中茄青枯病菌的丰度。菌落计数法测定病原菌种群密度，***在p<0.001水平上有显著性差异（Student's t检验）。无萎蔫症状且茎冠中不含可检测到的茄青枯菌的植物被归类为健康植物。表现出枯萎症状并含有可检测到的茄青枯菌的植物被归类为病株。潜在感染植物是指没有枯萎症状但含有可检测到的茄青枯菌的植物。

采样分类：

健康：无枯萎症状、未检测到病原菌。（无枯萎症状未检测到病原菌不算在内）

致病：有枯萎症状，可检测到病原菌。

群落特性：16s rRNA + 宏基因组

实验主要结果与讨论

1. 根际原生生物群落结构可预测植物健康，噬食性原生生物调控病原菌生长

图1注：病态和健康植物中细菌（a）、真菌（b）和原生生物（c）在植物生长过程中的香农指数多样性，病态和健康植物中细菌（d）、真菌（e）和原生生物（f）在植物生长过程中的整体群落结构。“n s”表示不显著，*表示P<0.05（n=8）

图2注：利用健康和患病植物（a）、健康植物数据集（b）和患病植物数据集（c）的组合数据集预测植物生长过程中致病性青枯菌密度的主要微生物参数的相对重要性。选择细菌、真菌和噬食性原生生物的多样性（Shannon指数）和结构（PCoA2）作为六个主要的微生物预测因子（图1）。星号的平均值P<0.05，两个星号的平均值P<0.01，三个星号的平均值P<0.001（用微生物预测因子与茄青枯菌之间的线性模型进行多元回归计算统计显著性）

      在这里，我们表明原生物的群落结构能够最好地预测健康和患病数据集中植物生长过程中的青枯病菌密度（图2a）。在健康植物中，细菌的多样性和群落结构可以显著预测病原菌密度（图2b），这与之前的研究结果一致，即土壤细菌组成可以预先决定未来植物的健康状况。在患病植物中，原生物群落结构是病原菌密度的最佳预测因子（图2 c）。在植物生长时，健康植物和患病植物之间的细菌（与真菌和原生生物相比）群落结构不同。

图3注:在植物建立时（第0周）原生动物分类群和功能群的群落结构解释疾病和健康植物之间的差异（a图）。植物建植时病株和健康株中嗜食性原生生物（b图）和指示原原生生物的OTUs（c图），以及植物建植时健康株和病株中与青枯病菌直接相关的噬食性原生生物功能群网络（d图）。植物生长过程中病株和健康株噬食性原生生物相对丰度与茄青枯菌的关系（e图）。在a组中，只选择了丰富的原生物分类和功能群（平均相对丰度超过1%）。在图a和b中，星号表示P<0.05。在c组中，LDA得分大于2.0的原寄主OTU是健康植物的指标，而LDA得分小于-2.0的原寄主OTU则属于疾病植物。在图d中，蓝线表示正相关，红线表示负相关。在图e中，实线显示显著相关（P<0.05），虚线显示非显著相关（P>0.05）

      我们发现植物生长时的噬食性原生生物对以后的植物健康具有指示意义，这一点可以从发生疾病的植物和保持健康的植物之间观察到的差异（ANOSIM，P=0.013）中看出（图3a，b）。在植物生长时，健康或患病的植物之间的其他原生生物功能和分类群的群落组成没有差异（图3a）。指示原生生物分析显示，在健康植物中有13个原生生物otu在植物生长时（有3个在病植物中）表明植物后期健康（图3c）。7个指示健康植物的原生otu被鉴定为嗜食菌，包括1个变形虫和6个尾蚴类群，它们可能全部或部分来源于捕食细菌。其中，原生生物 Pro_OTU8（Cercozoa，Trinematidae）在植物建立期最为丰富，跨植物生长占所有原生生物读数的11%左右。这个分类群可能代表了主要以细菌为食的噬食性原生生物。共发生网络分析显示，健康植物中的青枯病菌和原生生物OTUs之间的负相关比患病植物中的多（图3d）。尤其是嗜食菌（Trinematidae，Flectomonasekelundi，Proleptomonas faecicola和两个Eocercomonas spp）内的一个分类单元，都主要是噬食性原生生物的尾蚴以及一个嗜糖绿球藻（Chloriodium saccharphila）在植物建成时与病原体呈负相关（图3d）。虽然这些原生生物OTUs也存在于病株中，但在网络分析中它们与病原菌无关。       

        因此，我们得出结论，在植物发育过程中，噬食性原生生物和特定的分类群可以预测病原菌的密度和植物成熟时的健康状况，这是由噬食性原生生物的群落结构、噬食指示分类群所支持的，在共发生网络中，噬食性原生生物OTUs与病原菌呈负相关。这支持了一种观点，即功能单元而不是分类单元是微生物功能的基础，即使是在不同营养水平的微生物中功能单元也应该被视为更好的指标。另外我们发现总噬食性原生生物的相对丰度与植物生长过程中病株或健康病株组合数据中的青枯菌丰度呈负相关（回归分析，P<0.05）（图3e）。有趣的是，随着植物生长时间的延长，患病植物的总嗜食细胞相对丰度显著降低（图4）。

图4注：病株和健康株噬食性原生生物相对丰度与生长时间的关系

      噬食性原生生物可能在整个植物生长过程中控制病原菌的发育，因为当病原菌爆发时，病株中的嗜食原生生物相对丰度降低。尽管病原菌存在于健康的植物中，但在整个植物发育过程中，相对稳定的嗜食原生物数量可能有助于控制病原菌。总之，这些发现表明，在植物的生长中，噬食性原生生物和病原体之间的直接营养相互作用指导了植物后期的表现。相反，病株中的青枯菌与两种卵菌（OTU）正相关，其中包括一种可能的植物病原腐霉（图3d）。这表明在患病的植物中形成了一个病理生物群，这里包括同时感染不同病原体。然而，捕食者和被捕食者之间的相互作用的优势可能会减轻病原体的负面影响，从而刺激植物的健康。

2.  根际原生生物改变细菌功能基因进而影响植株健康

图5注：八种代谢基因和总代谢基因在植物生长过程中的相对丰度。[C] 能量生产和转换（a），[E]氨基酸运输和代谢（b），[F]核苷酸运输和代谢（C），[G]碳水化合物运输和代谢（d），[H]辅酶运输和代谢（E），[I]脂质运输和代谢（F），[P]无机离子运输和代谢（G），[Q]次级代谢产物生物合成，运输、分解代谢（h）和总代谢基因（i）。“n s”表示不显著，*表示在t-检验中P<0.05，**表示P<0.01（n=4）。

       我们发现原生生物可能通过细菌微生物群的功能变化来决定病原体的发育和植物的健康。健康植株在建株期表现出显著的与碳水化合物和辅酶功能相关的代谢基因相对丰度较高。值得注意的是，在第5周，大多数代谢基因在健康植株中的相对丰度显著高于患病植株。

图6注：在包括健康和患病植物在内的组合数据集中，八种代谢基因在预测植物生长过程中的相对重要性(a) 。在第0周和第5周患病和健康植株中代谢Q基因（次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢基因）相对丰度的变化（b）。病株和健康株在第0周和第5周嗜食原生生物的相对丰度（c）。第0周和第5周病株和健康植株中芽孢杆菌OTUs的相对丰度（d）。第0周和第5周病株和健康株中青枯病菌的丰度（e）。植物生长过程中大量的噬食性原生生物OTUs、细菌OTUs和代谢Q基因之间的共现网络（f）。在a图中，星号表示P<0.05，三个星号表示P<0.001（利用代谢基因与青枯病菌之间的线性模型进行多元回归计算统计显著性）。在b、c、d和e组中，“n s”表示无显著性，星号表示P<0.05，两个星号表示P<0.01，在student t-检验下（n=4表示代谢Q基因，n=8表示嗜食原生生物、芽孢杆菌和青枯菌）。在d图中，芽孢杆菌OTU的相对丰度结合了细菌OTU表中的两个芽孢杆菌OTU。在f图中，蓝线表示正相关，红线表示负相关。

       在8种代谢基因中，次级代谢产物生物合成[Q]基因与青枯菌密度的关联性最强（线性模型，P<0.001）（图6a）。此外，健康植物的代谢[Q]基因相对丰度随着时间的推移而增加，显示在第5周健康植物的代谢[Q]基因相对丰度明显高于患病植物（图6b）。在第0周、第3周和第4周，健康植物和患病植物的代谢[Q]基因没有差异（图5）。在第5周具有较高噬食性原生生物相对丰度（图6c）的健康植物相比于致病株具有较高代谢[Q]基因相对丰度、高Bacillus OTUs 相对丰度、低病原菌密度（图6e）。此外，包含噬食性原生生物otu、细菌otu和植物生长代谢[Q]基因的共现网络表明，在健康植物中噬食性原生生物与细菌（9个连接与7个负相关）和功能基因（2个相关）的相关性比在患病植物中（0个相关）的相关性更强（图6f）。尤其是在植物生长过程中，与病原菌呈负相关的Pro_OTU105（Cercozoa；Eocercomonas s P.）与6个细菌otu呈负相关。其中有一种细菌OTU（Bac_OTU17：拟杆菌；土单胞菌）与非核糖体肽合成酶基因（COG1020）正相关，COG1020是参与抑制青枯病菌的关键基因之一。未来需要利用分离的嗜食性原生生物和细菌菌株进行靶向实验来评估这种作用。健康植物表现出更多的噬食性原生生物OTU、细菌OTU和代谢[Q]基因，从而形成比患病植物（41个节点59个链接）更复杂的网络（55个节点90个链接）（图6f）。共发生网络中的特定连接只提供潜在相互作用的信息，但进一步的相互作用机制证明需要特定的共培养实验。除了单独的链接，网络结构和组成可以提供系统稳定性的见解，并增加提供生态系统服务的潜力，表明健康的植物受益于更复杂的网络的存在（与前面文章结论一致SBB/土传青枯病入侵破坏了根际细菌微生物组），其中噬食性原生生物细胞数量较多（一般营养水平较高的生物体）。

       我们的发现将实验室或温室研究的证据连接到田间条件下农业系统的群落水平，表明原生生物通过捕食影响细菌群落及其功能，导致植物性能的变化。与病株相比，健康株在病株病原症状首次出现的时间点是在5周后，具有较高相对丰度的噬食性原生生物、潜在的植物有益细菌和可能与病原抑制有关的次生代谢物基因。此外，噬食性原生生物与细菌呈负相关，细菌与植物生长过程中编码非核糖体肽的病原体抑制基因呈正相关。这一发现也可能有助于抑制病原体。然而，植物与根际微生物之间的相互作用是一个复杂的动态过程。未来的实验需要进一步研究植物是如何影响细菌、真菌和原生生物群落及其相互作用的，以及这些土壤微生物群落的变化如何反过来影响植物的表现。总之，我们认为捕食引起的微生物组分和功能的变化可能与控制病原菌的发育和植物的健康有关。

结论

        通过对植物生长过程中根际细菌、真菌和原生生物的整体微生物调查，我们发现除了细菌，原生生物也是预测植物健康的关键指标。在植物建立过程中，噬食性原生生物的群落组成可以预测在有病原菌存在的情况下植物的后期表现。这些原生生物可能通过直接取食病原体，引起细菌分类和功能组成的变化来保护植物。这些结果有望在作物生长之前，根据原生生物群落建立专门的系统来预测作物的性能。此外，我们的发现表明，通过应用关键微生物群掠食者：原生生物靶向微生物群工程有可能提高植物的性能。这将使我们更接近实现更可持续、减少杀虫剂的农业的理想状态。

总结

      这篇文章是2019年韦中老师在Science Advance上发表的Initial soil microbiome composition and functioning predetermine future plant health后续分析工作，揭示了原生生物也是预测植物健康的关键指标。译者认为美中不足的是对后续结果讨论不够，可能是因为原生生物在植物根微生物组中很少被关注，这也是本文最大的创新。在前面韦中老师发表的（SBB/土传青枯病入侵破坏了根际细菌微生物组）中，病原入侵过程中根际细菌群落结构发生变化，那篇文章就没有对真菌、原生生物等进行考虑，本文也是很大程度上对前面工作的延续与创新。

借鉴点：我们都知道在分子领域结构决定功能，而在整个生态系统中群落结构多大程度决定其功能至今一直在探讨，而本文这种从结构到功能的分析手段是值得学习与借鉴的。另外在设计非破坏性采样装置上，现阶段实验中用巧妙的装置来达到自身实验需要也值得我们去思考与创新。

微信号 : lida179438448

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