一些单细胞转录组R包的对象

对象应该是很重要的，至少是在R语言里面

ExpressionSet

Bioconductor的ExpressionSet是基石，多次讲解过，GEO数据库在R里面下载的就是这个对象。

通常不需要自己从头创建。

而单细胞转录组本质上也是转录组，即表达量矩阵的分析，所以后面的R包的对象，其实或多或少借鉴了这个Bioconductor的ExpressionSet对象。

CellDataSet

来自于monocle这个R包，使用其提供的 newCellDataSet() 函数即可创建，创建后的对象组成成分如下

• 表达矩阵：rows as features (usually genes) and columns as cells

• 使用 featureData and phenoData 函数可以获取基因和样本信息

• 其中 expressionFamily指定表达矩阵的归一化形式

归一化形式通常是3种

• tobit() FPKM, TPM

• negbinomial.size() UMIs, Transcript counts from experiments with spike-ins or relative2abs(), raw read counts

• gaussianff() log-transformed FPKM/TPMs, Ct values from single-cell qPCR

先介绍一下monocle需要的用来构建 CellDataSet 对象的三个数据集

• 表达量矩阵exprs:数值矩阵 行名是基因, 列名是细胞编号.

• 细胞的表型信息phenoData: 第一列是细胞编号，其他列是细胞的相关信息

• 基因注释featureData: 第一列是基因编号, 其他列是基因对应的信息

并且这三个数据集要满足如下要求:

表达量矩阵必须：

• 保证它的列数等于phenoData的行数

• 保证它的行数等于featureData的行数

而且

• phenoData的行名需要和表达矩阵的列名匹配

• featureData和表达矩阵的行名要匹配

• featureData至少要有一列"gene_short_name", 就是基因的symbol

准备Monocle对象需要的phenotype data 和 feature data 以及表达矩阵，从 scRNAseq 这个R包里面提取这三种数据。

library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
# Set assay to RSEM estimated counts
assay(fluidigm)  <-  assays(fluidigm)$rsem_counts
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4] 
sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm))

gene_ann <- data.frame(
  gene_short_name = row.names(ct), 
  row.names = row.names(ct)
)

pd <- new("AnnotatedDataFrame",
          data=sample_ann)
fd <- new("AnnotatedDataFrame",
          data=gene_ann)

sc_cds <- newCellDataSet(
  ct, 
  phenoData = pd,
  featureData =fd,
  expressionFamily = negbinomial.size(),
  lowerDetectionLimit=1)
sc_cds

这样就完成了CellDataSet对象的从头构建，它是后续分析的基石。

SingleCellExperiment

同样的也是那些信息：Different quantifications (e.g., counts, CPMs, log-expression) can be stored simultaneously in the assays slot. Row and column metadata can be attached using rowData and colData, respectively.

主要是scater包采用，也是可以从头构建。

创建代码如下：

library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
# Set assay to RSEM estimated counts
assay(fluidigm)  <- assays(fluidigm)$rsem_counts
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4]
table(rowSums(ct)==0)
# 这里使用原始表达矩阵，所以有很多基因在所有细胞均无表达量，即表现为没有被检测到，这样的基因是需要过滤掉的。

pheno_data <- as.data.frame(colData(fluidigm))
## 这里需要把Pollen的表达矩阵做成我们的 scater 要求的对象
#data("sc_example_counts")
#data("sc_example_cell_info") 
# 你也可以尝试该R包自带的数据集。
# 参考 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/scater/inst/doc/vignette-intro.R
sce <- SingleCellExperiment(
    assays = list(counts = ct), 
    colData = pheno_data
    )
sce
# 
# 

后面所有的分析都是基于 sce 这个变量 ，是一个 SingleCellExperiment 对象，被很多单细胞R包采用。

seurat 对象

主要是seurat包采用该对象，个人觉得并不是很方便，并不是上面的SingleCellExperiment 对象。

library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
# Set assay to RSEM estimated counts
assay(fluidigm) <- assays(fluidigm)$rsem_counts
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4]
names(metadata(fluidigm))
meta <- as.data.frame(colData(fluidigm))
counts <- ct
identical(rownames(meta),colnames(counts))
Pollen <- CreateSeuratObject(raw.data = counts, 
                             meta.data =meta,
                             min.cells = 3, 
                             min.genes = 200, 
                             project = "Pollen")
Pollen

并不一定要对象

有些单细胞转录组R包，就没有封装为特殊的对象，而是简单的list即可，比如M3Drop这个单细胞转录组R包：

library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm) 
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4] 
sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm))
counts=ct
library(M3Drop) 
Normalized_data <- M3DropCleanData(counts, 
                                   labels = sample_ann$Biological_Condition , 
                                   is.counts=TRUE, min_detected_genes=2000)
dim(Normalized_data$data)
length(Normalized_data$labels)
class(Normalized_data)
str(Normalized_data)

那你需要对象吗

你觉得对象重要吗，需要嘛？

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……未完待续……