scTrio-seq（逆向收费读文献2019-15）

系列目录

本次分享的文献发表于2018年11月30日，在Science 杂志，“Single-cell Multi-omics Sequencing and Analyses of Human Colorectal Cancer”， 该研究在国际上首次从单细胞分辨率、多组学水平深入解析了人类结直肠癌在发生和转移过程中，基因组拷贝数变异、DNA甲基化异常及基因表达改变的特点及相互关系。

Bian et al. used a single-cell triple omics sequencing (scTrio-seq) technique to examine the mutations, transcriptome, and methylome within colorectal cancer tumors and metastases from 10 individual patients.

来自于大名鼎鼎的Tang Fuchou 课题组，他们在单细胞领域的技术开发，和发育学应用的多产是有目共睹的：

• scRRBS (Genome Research, 2013);

• scMicrofluidic-seq (PNAS, 2014);

• SUPER-seq (Genome Biology, 2015);

• scTrio-seq (Cell Research, 2016);

• scCLEVER-seq (Cell Stem Cell, 2017b);

• scCOOL-seq (Cell Research, 2017);

• MR-seq (Science Bulletin, 2017)

关于scTrio-seq

早在2016年，一种创新性的单细胞三重组学测序（triple omics sequencing）技术：scTrio-seq就被汤富酬研究组发表了，并利用它揭示出了肝细胞癌中的遗传、表观遗传及转录组异质性。这一重要的研究发布在2016年2月23日的《Cell Research》杂志上。

2018年11月30日，汤富酬研究组对该团队已发表的scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing technique）技术进行了大幅度优化，极大地提升了对单个细胞转录组的检测效率和DNA甲基化位点（CpG位点）的覆盖度，达到与利用完整单细胞进行高精度转录组分析，或者利用完整单细胞进行高精度DNA甲基化组分析相近的效果。

有综述 Trends in Genetics, February 2017,   http://dx.doi.org/10.1016/j.tig.2016.12.003 对一些类似的技术进行比较：

也有综述 Lo PK, Zhou Q (2018) Emerging Techniques in Single-Cell Epigenomics and their Applications to Cancer Research. J Clin Genom.  总结了单细胞技术在表观领域的进展：

参考：

• http://www.nsfc.gov.cn/csc/20340/20343/33134/index.html

• http://jiangsu.china.com.cn/html/tech/rdzx/4430365_1.html

本研究纳入的病人队列

在文章附件有详细描述：

Patient ID	Gender	Age	AJCC Stage	Primary Site
CRC01	Female	50	IV	Left Colon
CRC02	Female	56	IV	Right Colon
CRC03	Male	60	III	Rectum
CRC04	Female	71	III	Right Colon
CRC06	Female	59	III	Left Colon
CRC09	Male	71	IV	Left Colon
CRC10	Male	63	III	Left Colon
CRC11	Female	51	III	Left Colon
CRC12	Female	49	III	Rectum
CRC13	Male	51	III	Left Colon
CRC14	Female	76	III	Rectum
CRC15	Female	79	IV	Right Colon

可以看到实验设计还是蛮周全的，每个病人在不同治疗时间点，都取样了，而且每个样品都使用了scTrio-seq技术进行探索。

取样的空间策略如下：

所以细胞数量还是蛮可观的，毕竟不是10X那种商业化仪器一次性批量操作几千个细胞。

单细胞基因组数据推断拷贝数变异

对每个病人取4个不同时间点样品，每个时间点还选取了不同空间位置的多个细胞，单细胞基因组数据推断拷贝数变异，作者这里使用的是  https://www.nature.com/articles/nmeth.3578  文章里面，找single-cell copy-number variations (CNVs)，大家可以试试看，是一个网页工具，非常容易使用。

可以看到，第一个病人的三百多个单细胞基因组数据，表明各个细胞的拷贝数变异非常接近。

单细胞转录组数据推断拷贝数变异

这个主要是基于broad开发的inferCNV软件所代表的算法，具体可以参考我以前在单细胞天地写的教程：

可以看到单细胞转录组数据推断的CNV和前面单细胞基因组数据推断的CNV还是很类似的。

基于拷贝数变异的细胞分群

总共是3种拷贝数变异事件：

• Clonal SCNAs were those shared by nearly all obtained single cancer cells.

• Sub-clonal SCNAs had intra-chromosomal breakpoints and were private to only a subset of the cancer cells.

• Some whole-chromosome-level SCNAs, which occurred frequently among the cancer cells, but were not consistent with genetic lineages, were non-clonal.

可以很清晰的看出来。

构建肿瘤进化树

本实验设计非常合理，从病人选取，不同疾病进展时期选取，不同空间位置的肿瘤细胞选取上面都有考究，所以可以合理的构建肿瘤进化树。

甲基化信号分群

对多个病人的所有细胞使用MDS算法，分辨率是 DNA methylation levels (1-kb tile)

热图展现如下：

EMT基因的表达量热图

既然是 The EMT-related genes’ expression levels  ，同理也可以展现甲基化信号的变化。

后记

因为本文是技术方法，所以并不需要有很强的生物学故事，只需要证明这个技术可靠，有用即可，所以作者对自己技术的数据产生了大量的图表，但是最后的结论是他们开发的单细胞多组学技术，可以辅助探索结直肠癌疾病发生发展和转移过程的分子机制。

如果想系统学习生信,下面的课程你可能会需要！ 

1

全国巡讲第17站

2

全国巡讲第18站

	课程内容
１	生信－R语言入门
２	GEO数据库挖掘
３	生信－LINUX基础
４	转录组课题设计和流程分析