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200块的代码我的学徒免费送给你，GSVA和生存分析
我们生信技能树B站又免费悄咪咪的上线了一个GSVA生存分析教学视频，然后学徒马上就学习了，居然是主动学习的，让我喜出望外！所以马上分享了他汇报给我的学习笔记,希望对你有帮助哦!
（现在学习量和弹幕都非常少，大家的机会来了哦！）
https://www.bilibili.com/video/av81874183
最近做的生存分析都是奇奇怪怪的，从来没有重复出作者的图。哈哈哈，但是我相信自己的代码是没有错的，只是参数设置跟作者不同而已。
最近跟着Jimmy老师的视频，学习用GSVA做生存分析，反反复复做了几次都无法复现作者的结果。
第一次是我找的基因集跟作者不一致，第二次可能参数不同，也只有一个显著性结果。
看了这篇推文，帮助你节约200块钱，可以多搓一顿火锅了。
看上图👆，不是我骗你，真的有人代码卖200块。好啦，正文开始啦！
学习前必须要知道的生物学知识
01生存分析(Survival analysis)是指根据试验或调查得到的数据对生物或人的生存时间进行分析和推断，研究生存时间和结局与众多影响因素间关系及其程度大小的方法，也称生存率分析或存活率分析。常见分析的用寿命表法、Kaplan-Meier，Cox回归等等. 构建在于病人分组后进行比较!
如果是多个基因,可以通过GSVA来进行分组再去做生存分析。
02GSVA (The Gene Set Variation Analysis package for microarray and RNA-seq data),算法太复杂，详情搜对应的R包。
我是大标题-1.读文献
第一步需要对文献进行解析，文献来源为Cell. 2018 May ：Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing
暂时跳过了这一步，因为时间有限，就先看了Jimmy老师的推文使用单细胞多组学探索TNBC病人的新辅助化疗疗效
大标题-2.数据库查询指定基因集的基因列表
msigdb数据库（找出基因集的基因）
根据一些feature分类；可能是unique，可能是multi
下载msigd数据库的all.gmt数据后，用Linux处理
2-1.下载gmt数据
打开对应的官网(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)
👆就是对应的gmt文件，我们下载基因名称的gmt文件
然后打开终端，cd到文件夹
ls -lh
结果如👇
这里做了两次，我分两次讲解，第二次会总结第一次的错误
下面是第一次的workflow
找到你想要的基因集的基因
###寻找基因集
grep -i epithelial_mesenchymal *
#h.all.v6.2.entrez.gmt:HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION 1281 1290 12892200 1277 2335 1293 5054 1278 1282 1284 1462 3486 7045 66784060 3915 4015 3918 1490 6876 1294 4017 1292 3685 7058 13074837 7168 1000 4313 1301 7057 2191 633 871 11167 10631 70706696 3371 7980 22795 3693 4314# 7431 4016 10516 1303 2006 10091311 6695 649 9235 3909 7076 5768 7078 7412 3491 10085 800 57692 2192 6443 1893 3908 10272 7169 3624 1601 2014 10409 36784256 7422 2919 7474 6382 5352 5118 26585 3688 50509 388 56542247 6641 1647 4232 131578 4982 966 59 30008 4147 26577 52702817 25890 2517 6586 284217 56937 1296 2201 3485 5217 6385 960 4616 3576 11010 290 64175 7424 4323 6444 5351 4148 10398 6535813 5396 51330 2331 3398 2669 5329 4638 7040 6422 8985 3569333 2199 4487 5806 8325 3725 10979 22943 6591 667 7171 16342697 5376 3487 1314 4035 3673 2316 8076 5744 7049 6424 39565999 1004 6303 4907 1809 5479 7052 6445 3690 8572 115908 18429244 374 3600 4176 2619 5645 23705 5021 7857 6372 4312 7128822 10486 25878 2303 50863 2026 355 627 8038 5817 6387 51599353 4853 79709 2882 7456
这里我下载成entrezID.gmt，后面重新下载。正确基因集的结果如👇
grep -i epithelial_mesenchymal *
#HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITIONCOL3A1 COL5A2 COL5A1 FBN1 COL1A1 FN1 COL6A3 SERPINE1 COL1A2 COL4A1 COL4A2 VCAN IGFBP3 TGFBI SPARC LUM LAMC1 LOX LAMC2 CCN2 TAGLN COL7A1 LOXL2 COL6A2 ITGAV THBS2 COL16A1 NNMT TPM1 CDH2 MMP2 COL11A1 THBS1 FAP BGN SERPINH1 FSTL1 POSTN THY1 SPP1 TNC TFPI2 NID2 ITGB5 MMP3 VIM LOXL1 FBLN5 COL12A1 ELN CDH11 COMP SPOCK1 BMP1 IL32 LAMA3 TIMP1 QSOX1 TIMP3 VCAM1 CCN1 EDIL3 CALD1 MAGEE1 FBLN1 SGCB ECM1 LAMA2 FSTL3 TPM2 INHBA DAB2 EMP3 BASP1 ITGA5 MGP VEGFA CXCL1 WNT5A SDC1 PLOD2 PCOLCE GREM1 ITGB1 COL5A3 RHOB HTRA1 FGF2 SNTB1 GADD45A MEST LRRC15 TNFRSF11B CD59 ACTA2 EFEMP2 MATN2 PCOLCE2 SERPINE2 GPC1 ABI3BP FUCA1 SLIT3 LAMA1 PMEPA1 COL8A2 FBN2 IGFBP2 PFN2 SDC4 CD44 GADD45B CXCL8 GLIPR1 ANPEP P3H1 VEGFC MMP14 SGCD PLOD1 MATN3 MYL9 SLC6A8 CALU PRRX1 TNFRSF12A FMOD ID2 GEM PLAUR MYLK TGFB1 SFRP1 PLOD3 IL6 APLP1 FBLN2 MSX1 PTX3 FZD8 JUN FERMT2 DKK1 SNAI2 DST TPM4 DCN GJA1 PMP22 IGFBP4 COPA LRP1 ITGA2 FLNA MFAP5 PTHLH TGFBR3 SFRP4 LGALS1 RGS4 CDH6 SAT1 NT5E DPYSL3 PPIB TGM2 SGCG ITGB3 PDLIM4 CTHRC1 ECM2 CRLF1 AREG IL15 MCM7 GAS1 PRSS2 CADM1 OXTR SCG2 CXCL6 MMP1 TNFAIP3 CAPG CAP2 MXRA5 FOXC2 NTM ENO2 FAS BDNF ADAM12 PVR CXCL12 PDGFRB SLIT2 NOTCH2 COLGALT1 GPX7 WIPF1
grep -i HALLMARK_HYPOXIA *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_HYPOXIA http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_HYPOXIAPGK1 PDK1 GBE1 PFKL ALDOA ENO2 PGM1 NDRG1 HK2 ALDOC GPI MXI1 SLC2A1 P4HA1ADM P4HA2 ENO1 PFKP AK4 FAM162A PFKFB3 VEGFA BNIP3L TPI1 ERO1A KDM3A CCNG2 LDHA GYS1 GAPDH BHLHE40 ANGPTL4 JUN SERPINE1 LOX GCK PPFIA4 MAFF DDIT4 SLC2A3 IGFBPNFIL3 FOS RBPJ HK1 CITED2 ISG20 GALK1 WSB1 PYGM STC1 ZNF292 BTG1 PLIN2 CSRP2VLDLR JMJD6 EXT1 F3 PDK3 ANKZF1 UGP2 ALDOB STC2 ERRFI1 ENO3 PNRC1 HMOX1 PGF GAPDHS CHST2 TMEM45A BCAN ATF3 CAV1 AMPD3 GPC3 NDST1 IRS2 SAP30 GAA SDC4 STBD1IER3 PKLR IGFBP1 PLAUR CAVIN3 CCN5 LARGE1 NOCT S100A4 RRAGD ZFP36 EGFR EDN2 IDS CDKN1A RORA DUSP1 MIF PPP1R3C DPYSL4 KDELR3 DTNA ADORA2B HS3ST1 CAVIN1 NR3C1 KLF6 GPC4 CCN1 TNFAIP3 CA12 HEXA BGN PPP1R15A PGM2 PIM1 PRDX5 NAGK CDKN1B BRS3 TKTL1MT1E ATP7A MT2A SDC3 TIPARP PKP1 ANXA2 PGAM2 DDIT3 PRKCA SLC37A4 CXCR4 EFNA3 CP KLF7 CCN2 CHST3 TPD52 LXN B4GALNT2 PPARGC1A BCL2 GCNT2 HAS1 KLHL24 SCARBSLC25A1 SDC2 CASP6 VHL FOXO3 PDGFB B3GALT6 SLC2A5 SRPX EFNA1 GLRX ACKR3 PAM TGFBIDCN SIAH2 PLAC8 FBP1 TPST2 PHKG1 MYH9 CDKN1C GRHPR PCK1 INHA HSPA5 NDST2 NEDD4TPBG XPNPEP1 IL6 SLC6A6 MAP3K1 LDHC AKAP12 TES KIF5A LALBA COL5A1 GPC1 HDLBP ILVBLNCAN TGM2 ETS1 HOXB9 SELENBP1 FOSL2 SULT2B1 TGFB3
grep -i HALLMARK_ANGIOGENESIS *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_ANGIOGENESIS http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_ANGIOGENESIS VCAN POSTN FSTL1 LRPAP1 STC1 LPL VEGFA PF4 THBD FGFR1 TNFRSF21 CCND2COL5A2 ITGAV SERPINA5 KCNJ8 APP JAG1 COL3A1 SPP1 NRP1 OLR1 PDGFA PTK2 SLCO2A1 PGLYRP1 VAV2 S100A4 MSX1 VTN TIMP1 APOH PRG2 JAG2 LUM CXCL6
grep -i HALLMARK_PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING MAPK8 PIK3R3 GRB2 NFKBIB MAP2K6 MAPK9 AKT1 MAPK1 PLCG1 TRIB3GSK3B MAP2K3 CDKN1A RAC1 RIPK1 AKT1S1 ACTR2 PRKAR2A YWHAB HRAS PDK1 PIKFYVE TBK1 ACTR3E2F1 MYD88 ITPR2 SQSTM1 RPS6KA1 PTPN11 MAPKAP1 PLCB1 RAF1 CAMK4 RPTOR CFL1 CDK4 TRAF2GNGT1 UBE2N ADCY2 CDKN1B VAV3 FGF6 ECSIT RALB ARF1 MKNK1 CDK1 PTEN ARHGDIA GRK2 FGF17 DDIT3 IRAK4 TIAM1 CDK2 SFN PRKCB GNA14 EIF4E CLTC TSC2 FGF22 PPP1CA DUSP3HSP90B1 IL4 STAT2 SLA EGFR PLA2G12A MAPK10 CALR THEM4 RIT1 MKNK2 PPP2R1B CAB39ARPC3 PITX2 NCK1 IL2RG PFN1 FASLG NOD1 DAPP1 UBE2D3 CAB39 AP2M1 MAP3K7 PRKAG1 CSNK2PRKAA2 ATF1 SLC2A1 PIN1 TNFRSF1A LCK RPS6KA3 NGF CXCR4 ACACA SMAD2 PAK4
grep -i BIOCARTA_ECM_PATHWAY *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:BIOCARTA_ECM_PATHWAY http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/BIOCARTA_ECM_PATHWAY MAPK3 PIK3CG HRAS MYL2 PIK3R1 MAP2K1 RAF1 RHOA ROCK1 FYN MAPK1 SHC1 TLN1 PFN1 GSN DIAPH1 PIK3CA ARHGAP5 ITGB1
这里有一个基因集找不到，只有查看来源文献Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways
结果是文献套文献，套娃么。。放弃掉，这5个应该也够了。
下面是用哪个metabric下载表达矩阵
2-2.metabric下载表达矩阵
官网为[http://www.cbioportal.org/datasets],这里下载需要的BRCA的数据
下载完成解压后内容如👇
主要用到临床信息、表达矩阵与体细胞变异文件
后面就可以放在R语言了完成🌶
2-3.制作GSVA的输入
主要是制作表达矩阵与临床信息
###读入表达矩阵与临床信息
rm(list = ls())
wkdir=getwd() #为工作目录赋值
options(stringsAsFactors = F)
##临床信息
clin=read.table(file.path(wkdir,'brca_metabric','data_clinical_patient.txt'),
header = T,sep='\t')
##表达矩阵
expr=read.table(file.path(wkdir,'brca_metabric','data_expression_median.txt'),
header = T,sep='\t')
expr[1:4,1:4]
# Hugo_Symbol Entrez_Gene_Id MB.0362 MB.0346
1 RERE 473 8.676978 9.653589
2 RNF165 494470 6.075331 6.687887
3 CD049690 NA 5.453928 5.454185
4 BC033982 NA 4.994525 5.346010
#需要将第一列作为行名并去掉第一、二列
rownames(expr)=expr$Hugo_Symbol
expr=expr[,-c(1,2)]
###这里Jimmy老师为了节省空间，只取了取前两位数
expr <- apply(expr, 2, function(x){
as.numeric(format(x,digits = 2)) #digit代表数字位数
})
rownames(expr)=gs
expr=na.omit(expr) #忽略NA值
接下来还需要做一些变化，因为表达矩阵的样本名是以"."分割
而临床信息是"-"分割
clin$PATIENT_ID = gsub('-','.',clin$PATIENT_ID) ##将“-”变为“.”
expr=clin[match(colnames(expr),clin$PATIENT_ID),] #防止错位进行配对矫正
###取TNBC亚型
clin1=clin[clin$CLAUDIN_SUBTYPE%in%c("Basal","claudin-low"),]
clin1=expr[,colnames(expr)%in%clin1$PATIENT_ID]
save(clin1,clin1,file = "GSVA_input.Rdata")
可以看到有427个病人属于这个亚型。如果不看Jimmy老师的视屏，我不会知道哪些是TNBC的。😃，生物学背景真的很重要，见推文没有生物学背景的数据分析很危险
2-4.gmt文件制作
用Linux将前面得到的基因集复制到一个文档，后缀为gmt
cat > GSVA_input.gmt
msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITIONCOL3A1 COL5A2 COL5A1 FBN1 COL1A1 FN1 COL6A3 SERPINE1 COL1A2 COL4A1 COL4A2 VCAN IGFBP3 TGFBI SPARC LUM LAMC1 LOX LAMC2 CCN2 TAGLN COL7A1 LOXL2 COL6A2 ITGAV THBS2 COL16A1 NNMT TPM1 CDH2 MMP2 COL11A1 THBS1 FAP BGN SERPINH1 FSTL1 POSTN THY1 SPP1 TNC TFPI2 NID2 ITGB5 MMP3 VIM LOXL1 FBLN5 COL12A1 ELN CDH11 COMP SPOCK1 BMP1 IL32 LAMA3 TIMP1 QSOX1 TIMP3 VCAM1 CCN1 EDIL3 CALD1 MAGEE1 FBLN1 SGCB ECM1 LAMA2 FSTL3 TPM2 INHBA DAB2 EMP3 BASP1 ITGA5 MGP VEGFA CXCL1 WNT5A SDC1 PLOD2 PCOLCE GREM1 ITGB1 COL5A3 RHOB HTRA1 FGF2 SNTB1 GADD45A MEST LRRC15 TNFRSF11B CD59 ACTA2 EFEMP2 MATN2 PCOLCE2 SERPINE2 GPC1 ABI3BP FUCA1 SLIT3 LAMA1 PMEPA1 COL8A2 FBN2 IGFBP2 PFN2 SDC4 CD44 GADD45B CXCL8 GLIPR1 ANPEP P3H1 VEGFC MMP14 SGCD PLOD1 MATN3 MYL9 SLC6A8 CALU PRRX1 TNFRSF12A FMOD ID2 GEM PLAUR MYLK TGFB1 SFRP1 PLOD3 IL6 APLP1 FBLN2 MSX1 PTX3 FZD8 JUN FERMT2 DKK1 SNAI2 DST TPM4 DCN GJA1 PMP22 IGFBP4 COPA LRP1 ITGA2 FLNA MFAP5 PTHLH TGFBR3 SFRP4 LGALS1 RGS4 CDH6 SAT1 NT5E DPYSL3 PPIB TGM2 SGCG ITGB3 PDLIM4 CTHRC1 ECM2 CRLF1 AREG IL15 MCM7 GAS1 PRSS2 CADM1 OXTR SCG2 CXCL6 MMP1 TNFAIP3 CAPG CAP2 MXRA5 FOXC2 NTM ENO2 FAS BDNF ADAM12 PVR CXCL12 PDGFRB SLIT2 NOTCH2 COLGALT1 GPX7 WIPF1
msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_HYPOXIA http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_HYPOXIAPGK1 PDK1 GBE1 PFKL ALDOA ENO2 PGM1 NDRG1 HK2 ALDOC GPI MXI1 SLC2A1 P4HA1ADM P4HA2 ENO1 PFKP AK4 FAM162A PFKFB3 VEGFA BNIP3L TPI1 ERO1A KDM3A CCNG2 LDHA GYS1 GAPDH BHLHE40 ANGPTL4 JUN SERPINE1 LOX GCK PPFIA4 MAFF DDIT4 SLC2A3 IGFBPNFIL3 FOS RBPJ HK1 CITED2 ISG20 GALK1 WSB1 PYGM STC1 ZNF292 BTG1 PLIN2 CSRP2VLDLR JMJD6 EXT1 F3 PDK3 ANKZF1 UGP2 ALDOB STC2 ERRFI1 ENO3 PNRC1 HMOX1 PGF GAPDHS CHST2 TMEM45A BCAN ATF3 CAV1 AMPD3 GPC3 NDST1 IRS2 SAP30 GAA SDC4 STBD1IER3 PKLR IGFBP1 PLAUR CAVIN3 CCN5 LARGE1 NOCT S100A4 RRAGD ZFP36 EGFR EDN2 IDS CDKN1A RORA DUSP1 MIF PPP1R3C DPYSL4 KDELR3 DTNA ADORA2B HS3ST1 CAVIN1 NR3C1 KLF6 GPC4 CCN1 TNFAIP3 CA12 HEXA BGN PPP1R15A PGM2 PIM1 PRDX5 NAGK CDKN1B BRS3 TKTL1MT1E ATP7A MT2A SDC3 TIPARP PKP1 ANXA2 PGAM2 DDIT3 PRKCA SLC37A4 CXCR4 EFNA3 CP KLF7 CCN2 CHST3 TPD52 LXN B4GALNT2 PPARGC1A BCL2 GCNT2 HAS1 KLHL24 SCARBSLC25A1 SDC2 CASP6 VHL FOXO3 PDGFB B3GALT6 SLC2A5 SRPX EFNA1 GLRX ACKR3 PAM TGFBIDCN SIAH2 PLAC8 FBP1 TPST2 PHKG1 MYH9 CDKN1C GRHPR PCK1 INHA HSPA5 NDST2 NEDD4TPBG XPNPEP1 IL6 SLC6A6 MAP3K1 LDHC AKAP12 TES KIF5A LALBA COL5A1 GPC1 HDLBP ILVBLNCAN TGM2 ETS1 HOXB9 SELENBP1 FOSL2 SULT2B1 TGFB3
msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_ANGIOGENESIS http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_ANGIOGENESIS VCAN POSTN FSTL1 LRPAP1 STC1 LPL VEGFA PF4 THBD FGFR1 TNFRSF21 CCND2COL5A2 ITGAV SERPINA5 KCNJ8 APP JAG1 COL3A1 SPP1 NRP1 OLR1 PDGFA PTK2 SLCO2A1 PGLYRP1 VAV2 S100A4 MSX1 VTN TIMP1 APOH PRG2 JAG2 LUM CXCL6
msigdb.v7.0.symbols.gmt:HALLMARK_PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HALLMARK_PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING MAPK8 PIK3R3 GRB2 NFKBIB MAP2K6 MAPK9 AKT1 MAPK1 PLCG1 TRIB3GSK3B MAP2K3 CDKN1A RAC1 RIPK1 AKT1S1 ACTR2 PRKAR2A YWHAB HRAS PDK1 PIKFYVE TBK1 ACTR3E2F1 MYD88 ITPR2 SQSTM1 RPS6KA1 PTPN11 MAPKAP1 PLCB1 RAF1 CAMK4 RPTOR CFL1 CDK4 TRAF2GNGT1 UBE2N ADCY2 CDKN1B VAV3 FGF6 ECSIT RALB ARF1 MKNK1 CDK1 PTEN ARHGDIA GRK2 FGF17 DDIT3 IRAK4 TIAM1 CDK2 SFN PRKCB GNA14 EIF4E CLTC TSC2 FGF22 PPP1CA DUSP3HSP90B1 IL4 STAT2 SLA EGFR PLA2G12A MAPK10 CALR THEM4 RIT1 MKNK2 PPP2R1B CAB39ARPC3 PITX2 NCK1 IL2RG PFN1 FASLG NOD1 DAPP1 UBE2D3 CAB39 AP2M1 MAP3K7 PRKAG1 CSNK2PRKAA2 ATF1 SLC2A1 PIN1 TNFRSF1A LCK RPS6KA3 NGF CXCR4 ACACA SMAD2 PAK4
msigdb.v7.0.symbols.gmt:BIOCARTA_ECM_PATHWAY http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/BIOCARTA_ECM_PATHWAY MAPK3 PIK3CG HRAS MYL2 PIK3R1 MAP2K1 RAF1 RHOA ROCK1 FYN MAPK1 SHC1 TLN1 PFN1 GSN DIAPH1 PIK3CA ARHGAP5 ITGB1
结果如👇
大标题-3.GSVA
有了上面的文件就可以利用GSVA计算了
library(GSVA)
library(stringr)
gs=readLines("GSVA_input.gmt")#读入基因集
gs1 <- lapply(gs, function(x)
{x=strsplit(x,"\t")[[1]] #通过\t分割
y=x[3:length(x)] #不取前两行，因为不是基因
return(y)}) #返回y值
X=expr
es.max <- gsva(X, gs1,mx.diff=FALSE, verbose=FALSE, parallel.sz=1)
rownames(es.max)=unlist(lapply(gs, function(x)
{x=strsplit(x,"\t")[[1]][1]
x=strsplit(x,":")[[1]][2]}))
es.dif <- gsva(X, gs1, mx.diff=TRUE, verbose=FALSE, parallel.sz=1)
rownames(es.dif)=rownames(es.max) #行名命名
save(es.max,es.dif,gs1,file = "es_output.Rdata")
save(es.max,es.dif,gs1,file = "es_output.Rdata")
👆是两种算法的差异结果，具体我也没有看太懂，根据文章设置参数就好。
大标题-4.生存分析
两部分：es.max/es.dif
es.max
library(survival)
library(survminer)
phe$event=ifelse(phe$OS_STATUS=='DECEASED',1,0) #分为死亡与生存2种情况
phe$time=as.numeric(phe$OS_MONTHS) #根据月份划分
rownames(phe)=gsub("-",".",phe$PATIENT_ID) #同上面一样需要变一下分割符
ids=intersect(rownames(phe),colnames(es.max)) #取交集
phe=phe[ids,] #取子集
es.max=es.max[,ids] #取子集
筛选完成后只剩398个样本
根据文献大于0.1为“high，小于”-0.1“为low，方法就是用的GSVA，所以这里我们对其进行分组
for (i in 1:5){
phe1=phe[abs(es.max[i,]) > 0.1,]
es.max1=es.max[,abs(es.max[i,]) > 0.1]
phe1$group_list=ifelse(es.max1[i,] > 0.1,'high','low')
# 利用ggsurvplot快速绘制漂亮的生存曲线图
sfit <- survfit(Surv(time, event)~group_list, data=phe1)
p=ggsurvplot(sfit, conf.int=F, pval=TRUE,legend.title=rownames(es.max)[i])
print(p$plot)
ggsave(filename = paste0("0.1",rownames(es.max)[i],".pdf"))}
dev.off()
结果如👇，没有一个显著
但当我把参数调为0.2的时候居然第一个基因集ECM显著，但是并不是文章中显著的2个基因集（AKT、HYPOXIA)
下面我用另一种方法试一下
es.dif
方法跟👆差不多
phe=clin1[clin1$OS_STATUS %in% c('DECEASED','LIVING'),]
phe$event=ifelse(phe$OS_STATUS=='DECEASED',1,0)
phe$time=as.numeric(phe$OS_MONTHS)
colnames(phe)
rownames(phe)=gsub("-",".",phe$PATIENT_ID)
ids1=intersect(rownames(phe),colnames(es.dif))
phe=phe[ids1,]
es.dif=es.dif[,ids1]
for (i in 1:5){
phe2=phe[abs(es.dif[i,]) > 0.1,]
es.dif1=es.dif[,abs(es.dif[i,]) > 0.1]
phe2$group_list=ifelse(es.dif1[i,] > 0.1,'high','low')
# 利用ggsurvplot快速绘制漂亮的生存曲线图
sfit <- survfit(Surv(time, event)~group_list, data=phe2)
p=ggsurvplot(sfit, conf.int=F, pval=TRUE,legend.title=rownames(es.max)[i])
print(p$plot)
ggsave(filename = paste0("0.1_i",rownames(es.dif)[i],".pdf"))}
结果如👇
参数为0.1，只有第一个基因集ECM显著
参数为0.2时，也是只有第一个基因集ECM显著
大标题-插曲
前面在下载gmt数据那里做了两次，第一次在上面已经讲解了，下面是第二次的探索过程，第二次会总结第一次的错误。
那么为什么有如此大的差别呢？方法与文中一致，那么只可能是数据出现的问题。检查文章，果然发现筛选的基因集不一致。前面我们主要筛选的是HALLMARK的基因集，是由多个已知的基因集构成的超基因集
而文章里用的是以前文章发表的基因集
那应该怎么搜索基因集呢？我找到了规律,只需要搜索作者名字+基因集名称就可以了
grep HARRIS_HYPOXIA *
结果如下面
这就是我们所需要的基因集了，其他基因集方法类似
grep HARRIS_HYPOXIA *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:HARRIS_HYPOXIA http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/HARRIS_HYPOXIA PLAUR PGK1 JUN VEGFA XRCC5 RP1 HIF1A CA9 PGF BNIP3 PKM ALDOA BNIP3L BHLHE40 HGF TFF3 ENO1 HK2 F3 CP SPP1 FOS HMOX1 DDIT3 HDAC9 AK3 EDN1 P4HA1 TH EPAS1 IGFBP3 CCL2 STC1 LDHA COL5A1 FLT1 CA12 PDGFB TEK IGF2 PTGS2 CD99 TXN CDKN1A PFKL XRCC6 SAT1 TGFB1 FTL TFRC LRP8 CXCL8 NFKB1 TF TAGLN CCNG2 TGM2 EDN2 IL6 BIK PFKP ANGPT2 TGFA EPO SLC2A1 ADM VIM SLC2A3 IGFBP1 L1CAM GAPDH CDKN1B MIF TGFB3 IGFBP2 APEX1 FGF3 PRPS1 HK1 MMP13 ENPEP
grep CREIGHTON_AKT1_SIGNALING *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:CREIGHTON_AKT1_SIGNALING_VIA_MTOR_UP http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/CREIGHTON_AKT1_SIGNALING_VIA_MTOR_UP NEDD8 BRMS1 CDK16 SPINT1 DDR1 LASP1 CLSTN1 MVK PRKCD UBE2M AC004156.1 NEU1 CORO1B CYB561 KCTD5 SYNJ2BP CDC34 TJP3 HNRNPAB SLC37A1 NECTIN2 ADIPOR1 BSG BIK AKT1 DUSP10 MMP15 POR GPX4 ARHGEF16 CLDN3 TMED10 TOLLIP PMPCA
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:CREIGHTON_AKT1_SIGNALING_VIA_MTOR_DN http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/CREIGHTON_AKT1_SIGNALING_VIA_MTOR_DN TNFRSF12A RGL2 PFKL PPP4C CIB1 ATP6V0B PPP2R1A KRT8 DHCR7 MRPS7 TUBB4B YWHAB ALDOA PAFAH1B3 GOT1 TOM1 ATP6AP1 CTSA ATP6V0C MIF GPI ATP6V1F TSPAN1
grep ONDER_CDH1 *
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:ONDER_CDH1_TARGETS_3_UP http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/ONDER_CDH1_TARGETS_3_UP TSC22D3 KDELR3 ZBTB16 MAGED1 STC2 CYP1B1 MAGED2 LEPR ALDH6A1 TCEA2 WIPI1 KCNMA1 RNASE4 S100A8 CRIP2 FTL PRKCA KLF9
#msigdb.v7.0.symbols.gmt:ONDER_CDH1_TARGETS_3_DN http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/ONDER_CDH1_TARGETS_3_DN CXCL1 EPN3 PTGS2 DSC2 NAV3 EDN1 SOX9 KRT13 CWH43 LCN2 TGFA SCEL HS3ST2 C1orf116 FST HBEGF CEACAM6 SPRR2D IL1R2 MFAP5 TMPRSS11E CRCT1 IVL KLK10 IL36G EHF ADGRE2 SERPINB2 P2RY2 SERPINB13 ATP12A IL1B CXCL8 KRT8 MYO5C KLK11 KLK7 SPAG1 ARL4C MARC1 CYB5R2 CXCL2 ST6GALNAC5 ANO1 KRT15 PI3 GPRC5A SERPINB1 TP63 PTHLH CSF3 DEPP1 DUSP6 ARHGAP25 CXCL3 CSF2 VGLL1 MMP10 S100A7
其他的3个基因集文章没有并给文献，只能默认用HALLMARK的基因集
下面是第二次的workflow
其实跟第一次类似，不同的地方做注释，相似的地方不在赘述。这里以hypoxia基因集作为🌰，其他的基因集类似
rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load("data/metabric_clinical.Rdata")
load("data/metabric_expression.Rdata")
clin1=clin[clin$CLAUDIN_SUBTYPE%in%c("Basal","claudin-low"),]
class(expr)
class(expr1)
library(GSVA)
library(stringr)
gs=readLines("harris_hypoxia.gmt") #记得这里要替换成不同基因集的gmt
gs1 <- lapply(gs, function(x)
{x=strsplit(x,"\t")[[1]]
y=x[3:length(x)]
return(y)})
X=expr
hy.max <- gsva(X, gs1,mx.diff=FALSE, verbose=FALSE, parallel.sz=1)#max法
rownames(hy.max)=unlist(lapply(gs, function(x)
{x=strsplit(x,"\t")[[1]][1]
x=strsplit(x,":")[[1]][2]}))
hy.dif <- gsva(X, gs1, mx.diff=TRUE, verbose=FALSE, parallel.sz=1)#diff法
rownames(hy.dif)=rownames(hy.max)
save(hy.max,hy.dif,gs1,file = "hy_hypoxia.Rdata")#存储一下
load("hy_hypoxia.Rdata")
library(survival)
library(survminer)
library(stringr)
dim(clin)
clin[1:4,1:4]
# 终点事件(outcome event)又称失效事件(failure event) 或死亡事件(death event)
# 这种分组资料的生存分析常采用寿命表法(life-table method)
# 生存分析也经常采用Kaplan-Meier曲线及log-rank检验
table(clin$VITAL_STATUS)
table(clin$OS_STATUS)
# 理论上这个时候需要区分 Died of Disease和Other Caushy
phe=clin1[clin1$OS_STATUS %in% c('DECEASED','LIVING'),]
phe$event=ifelse(phe$OS_STATUS=='DECEASED',1,0)
phe$time=as.numeric(phe$OS_MONTHS)
colnames(phe)
rownames(phe)=gsub("-",".",phe$PATIENT_ID)
ids=intersect(rownames(phe),colnames(hy.max))
phe=phe[ids,]
hy.max=as.matrix(hy.max)#因为只有一列，需要转换成矩阵
hy.max=hy.max[,ids]
hy.max=as.matrix(hy.max)#因为只有一列，需要转换成矩阵
phe[1:4,1:4]
phe1=phe[abs(hy.max[1,]) > 0.1,]
hy.max1=hy.max[,abs(hy.max[1,]) > 0.1]
hy.max1=t(as.matrix(hy.max1)) #因为只有一列，需要转换成矩阵并转置，不然会报错
phe1$group_list=ifelse(hy.max1[1,] > 0.1,'high','low')
# 利用ggsurvplot快速绘制漂亮的生存曲线图
sfit1 <- survfit(Surv(time, event)~group_list, data=phe1)
p1=ggsurvplot(sfit1, conf.int=F, pval=TRUE,legend.title="hypoxia")
p1
dev.off()
###diff
phe=clin1[clin1$OS_STATUS %in% c('DECEASED','LIVING'),]
phe$event=ifelse(phe$OS_STATUS=='DECEASED',1,0)
phe$time=as.numeric(phe$OS_MONTHS)
colnames(phe)
rownames(phe)=gsub("-",".",phe$PATIENT_ID)
ids1=intersect(rownames(phe),colnames(hy.dif))
phe=phe[ids1,]
hy.dif=hy.dif[,ids1]
hy.dif=as.matrix(hy.dif)
phe2=phe[abs(hy.dif[1,]) > 0.1,]
hy.dif1=hy.dif[,abs(hy.dif[1,]) > 0.1]
hy.dif1=t(as.matrix(hy.dif1))
phe2$group_list=ifelse(hy.dif1[1,] > 0,'high','low')
# 利用ggsurvplot快速绘制漂亮的生存曲线图
sfit2 <- survfit(Surv(time, event)~group_list, data=phe2)
p2=ggsurvplot(sfit2, conf.int=F, pval=TRUE,legend.title="hypoxia")
p2
dev.off()
最终结果如👇
0.1的阈值，MAX法结果只有文章中显著的1个基因集（AKT)显著，另一个HYPOXIA并不显著
0.1的阈值，diff法结果文章中显著的1个基因集（AKT)显著，另一个HYPOXIA并不显著，另外ECM基因集也显著
综上所述，生存分析就是任人打扮的小姑娘，不同参数,不同数据集,不同基因集,不同方法结果就会不一样，只要细心调整参数，总有你想要的结果,虽然听起来有点不寒而栗!
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