认识免疫组库测序数据

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前面我带领大家通过IMGT数据库认知免疫组库，而且也一起从IMGT数据库下载免疫组库相关fasta序列，免疫组库重要的研究对象就是分成BCR的IGH,IGK,IGL这3类，以及TCR的TRA,TRB,TRD,TRG，它们各自都有V，D（可选），J，C基因。

已经预告了有一个免疫组库的实战，现在终于有时间来带领大家搞定它。

• 来自于文章；https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/2162402X.2019.1644110
• 数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJEB33490

首先研读文献，并且找到其测序数据文件存放的数据库，并且成功下载到！

完成这个数据下载，需要熟悉GEO和SRA数据库，参考：

下载得到的fastq.gz 文件，如下所示：

  7.8M May 23 09:43 ERR3445007_1.fastq.gz
    11M May 23 09:43 ERR3445007_2.fastq.gz
   9.8M May 23 09:43 ERR3445008_1.fastq.gz
    14M May 23 09:43 ERR3445008_2.fastq.gz
   7.0M May 23 09:44 ERR3445009_1.fastq.gz
    10M May 23 09:44 ERR3445009_2.fastq.gz
   7.2M May 23 09:44 ERR3445010_1.fastq.gz
   9.3M May 23 09:44 ERR3445010_2.fastq.gz

我们简单的批量走一下fastqc软件质控：

ls raw/*gz|xargs fastqc -t 6 -o qc/

因为数据量都很小，所以几分钟就ok啦。那我们随机挑选一个样本的fastqc报告看看吧：

首先看summary表格

如下：

summary表格

可以看到，单独的免疫组库样本测序数据库很小，还不到10万条序列，跟10X的单细胞有的一拼哦，正常人类的转录组都是20~50M的。。。

而且这个测序程度高达300，那就是miseq测序仪啦。

reads的每个碱基位置的测序质量分布

reads的长度是300bp，所以横坐标是1到300，纵坐标是碱基质量值，通常是20或者30以上比较好。如下：

reads的每个碱基位置的测序质量分布

可以看到， 随着reads的碱基数量增加，后面的碱基测序质量越来越差，符合测序仪的实际情况。。。。

末端那些质量差的碱基，在我们的测序数据质控阶段，会控制软件和参数去除掉它们的哈。

每个碱基位置的GC含量分布

reads的长度是300bp，所以横坐标是1到300，GC含量如果是全基因组测序，那么应该是一条线。但是这个免疫组库测序，下面图虽然说被fastqc软件判定为不合格，但实际上对免疫组库测序来说，是合格的哈。如下：

每个碱基位置的GC含量分布

有非常多的重复序列

这个其实你自己从IMGT数据库下载免疫组库相关fasta序列，探索一下就明白了。因为本来测序的就是BCR的IGH,IGK,IGL这3类，以及TCR的TRA,TRB,TRD,TRG，它们各自都有V，D（可选），J，C基因。这些不同的V基因其实很类似，J基因也是非常类似，所以都是重复序列就对了。如下：

重复序列

miseq测序仪的300bp的双端测序质控步骤

参考发表在Front. Immunol., 30 April 2019的综述：The Pipeline Repertoire for Ig-Seq Analysis

• 文章链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.00899/full

免疫组库质控

其中双端测序的reads合并也是有一系列软件可以实现。

下游分析

数据分析大纲如下：

• 测序数据评估与过滤；
• 不同种类V,D/J基因的数目、频率统计；
• 不同种类V-J组合（气泡图）和V-D-J组合（桑基图）的数目、频率统计；
• V基因、J基因、V-J组合、V-D-J组合的组间差异比较；（火山图）
• CDR3氨基酸克隆型的数目、频率、长度统计；
• 基于CDR3氨基酸克隆型频率的样本间相似性评估；
• CDR3氨基酸克隆型的多样性分析，包括Gini、Simpson、Shannon、Rank Abundance；
• CDR3氨基酸克隆型差异表达分析；
• 样本间共有CDR3氨基酸克隆分析；

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