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cellranger更新到4啦(全新使用教程)

生信技能树 生信技能树 2022-06-06

目前单细胞转录组以10X公司为主流,我们也是在单细胞天地公众号详细介绍了cellranger流程,大家可以自行前往学习,如下:

但是这个两年前的系列笔记是基于V2,V3版本的cellranger,目前呢它更新到了版本4,有一些改变,所以有必要再总结一个笔记

软件下载及安装

同样的,需要自己简单注册后就可以获取wget下载地址,因为版权的问题,我这里就不复制粘贴出来地址啦,反正简单填写邮箱即可注册拿到地址。

注册网页是: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest


一般来说,软件以及配套的数据库都需要下载,下载速度呢,就取决于你自己的网路情况啦,反正在中国大陆地区下载肯定会很慢的,建议nohup到后台,等一个晚上即可,我下面秀给你看两个不同的速度情况:


下载成功后的文件夹如下所示:

972M Jul  4 05:18 cellranger-4.0.0.tar.gz
11G Jun 23 02:04 refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

因为不做小鼠的数据,所以我只是下载了 refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz 这个数据库文件。

再看看我们的10x下机后的fastq数据文件

10X单细胞数据比较特殊,它的测序文库中包括index、barcode、UMI和测序reads。利用mkfastq或者bcl2fastq生成的文件,大概长这样:


可以看到,截图里面是两个样本,其中一个样本有4次测序文件,每次测序文件都是 I1,R1,R2这3个fastq文件。

官网给指出来了文件名规则:https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/2.0/using/fastq-input#wrongname ,如果你的fastq数据不是这样命名,就需要自行更改过来了,我上面截图的就是需要修改的,因为里面混入了AK这样的编号。

如果要理解这3个文件的区别,同理,也是需要自己去学习了解10x的原理,我这里就不再赘述:

  • 首先,1-26个cycle就是测序得到了26个碱基,先是16个Barcode碱基,然后是10个UMI碱基;

  • 然后,27-34这8个cycle得到了8个碱基,就是i7的sample index;

  • 最后35-132个cycle得到了98个碱基,就是转录本reads

使用Cell Ranger

Cell Ranger主要的流程有:拆分数据 mkfastq、细胞定量 count、定量组合 aggr、调参reanalyze,还有一些小工具比如mkref、mkgtf、upload、sitecheck、mat2csv、vdj、mkvdjref、testrun。

但是,大概率上,我们只需要使用它的定量流程,就是 cellranger count 命令,教程在consult Running 10x Pipelines on FASTQ Files,主要就是需要把软件和配套的数据库文件,以及10x的fastq文件准备好。

如下所示:

bin=../pipeline/cellranger-4.0.0/bin/cellranger
db=../pipeline/refdata-gex-GRCh38-2020-A
fq_dir=../raw/HP4540_2
$bin count --id=HP4540-2 \
--localcores=4 \
--transcriptome=$db \
--fastqs=$fq_dir \
--sample=HP4540-2 \
--expect-cells=5000

是不是超级简单,值得注意的是我把样本名字进行了修改,才成功运行这个 cellranger count 命令。服务器配置不一样,这个cellranger count流程运行时间不一样,我上面截图的一个样本是60G的fq文件数据走这个流程是5小时。

输出文件超级多,如下所示:


简单介绍如下:

  • web_summary.html:这个是必须要看的,粗略浏览本次10x样本走cellranger count流程的运行质量

  • metrics_summary.csv:CSV格式数据摘要,可以不看

  • possorted_genome_bam.bam:比对文件,超级大的bam文件,可以不看

  • possorted_genome_bam.bam.bai:前面bam文件的索引文件,可以不看

  • filtered_gene_bc_matrices:是超级重要的一个目录,下面又包含了 barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz,是下游Seurat、Scater、Monocle等分析的输入文件

    • outs/filtered_feature_bc_matrix/matrix.mtx.gz
      outs/filtered_feature_bc_matrix/features.tsv.gz
      outs/filtered_feature_bc_matrix/barcodes.tsv.gz
  • filtered_feature_bc_matrix.h5:过滤掉的barcode信息HDF5 format,可以不看

  • raw_feature_bc_matrix:原始barcode信息,可以不看

  • raw_feature_bc_matrix.h5:原始barcode信息HDF5 format,可以不看

  • analysis:数据分析目录,下面又包含聚类clustering(有graph-based & k-means)、差异分析diffexp、主成分线性降维分析pca、非线性降维tsne,因为我们会自己走Seurat、Scater、Monocle等分析,所以这个也不看。

  • molecule_info.h5:进行aggregate使用的文件,可以暂时不看

  • cloupe.cloupe:官方可视化工具Loupe Cell Browser 输入文件,我们通常不需要可视化软件,可以不看

10X单细胞转录组免费分析

我最近成功招募了几个实习生,所以可以继续开启免费数据分析活动啦。其实数据分析对我来说其实就没有成本,无非就是跑一下流程,关键是沟通起来太费劲,大家只需要把10X单细胞转录组的fq数据给到我,我就免费给大家跑流程,以及出几百个图表给到你。但是我不会给你解释任何细节知识点,也不要试图添加我微信哈,绝大部分生信技能树粉丝都没有机会加我微信。已经多次满了5000好友,所以我开通了一个微信好友,前100名添加我,仅需150元即可,3折优惠期机会不容错过哈。我的微信小号二维码在:0元,10小时教学视频直播《跟着百度李彦宏学习肿瘤基因组测序数据分析》

我会安排实习生去给你解释我的10X单细胞转录组的结果和图表,当然了,你也可以自己学,课题设计可以看我们以前的教程:

还有:使用seurat3的merge功能整合8个10X单细胞转录组样本seurat3的merge功能和cellranger的aggr整合多个10X单细胞转录组对比

技术细节可以看:

另外,我创立了《单细胞天地》这个公众号,并且制作了两个视频:

全网第一个单细胞课程(免费基础课程)
  • 免费学习地址在B站:https://www.bilibili.com/video/av38741055 ,欢迎提问弹幕交流!
  • 务必听课后完成结业考核20题:https://mp.weixin.qq.com/s/lpoHhZqi-_ASUaIfpnX96w
  • 课程配套资料文档在:https://docs.qq.com/doc/DT2NwV0Fab3JBRUx0
技能树出品的第二个单细胞课程(进阶课程,仍然免费)
  • 详情请自行阅读介绍 https://mp.weixin.qq.com/s/bLfO-8ri_SNUepGs4UwRQw
  • 本课程长期答疑文档,https://docs.qq.com/doc/DT0FxbEpHYU5ZVlpu

因为课程涉及到知识点太多,所以我拆分成为了5个子课程,欢迎B站提问弹幕交流!全部链接是:

  • 「生信技能树」单细胞进阶数据处理之文献导读,链接是:https://www.bilibili.com/video/BV17f4y1R7N8
  • 「生信技能树」使用10X单细胞转录组数据探索免疫治疗,链接是:https://www.bilibili.com/video/BV1xD4y1S74P
  • 「生信技能树」单细胞基因组数据拷贝数变异分析流程,链接是:https://www.bilibili.com/video/BV1Yf4y1R75R
  • 「生信技能树」云服务器处理单细胞转录组数据,链接是:https://www.bilibili.com/video/BV154411Z7DU
  • 「生信技能树」使用Smart-seq2单细胞转录组数据探索小鼠性腺发育,链接是:https://www.bilibili.com/video/BV1454y1q77Z

也希望可以帮助到你。

其它数据分析也免费

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