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明码标价之10X转录组原始测序数据的cellranger流程

生信技能树 生信技能树 2022-06-06

冷知识:其实一个10X单细胞转录组样品可以有多达84个fastq文件哦!

我们在单细胞天地多次分享过cellranger流程的笔记,大家可以自行前往学习,如下:

因为这个流程其实是需要10X单细胞转录组的fastq文件,而且呢,命名是有规则的!

如果你的样品被分散到了多个library、flowcell,就会出现一个样品有84个fastq文件的情况,恰好我看到了一个文献里面的数据就是这样的情况。该研究于2021年3月发表在《Nature Communications》杂志的文章, 标题是:《Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors》,链接是:https://www.nature.com/articles/s41467-021-21783-3

如下所示的一个样品,是SIGAA11, 足足有84个fastq文件,如下所示:

SIGAA11_S37_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L009_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L009_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L009_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L009_I1_001.fastq.gz

如果你仔细观察这84个fastq文件的名字,就会发现规律,如果以下划线为分隔符,那么

  • 第2列是S37到S40这4种情况
  • 第3列是L003到L009这7种情况
  • 第五列是R1,R1,I1这样的3种情况

总共就是 4x7x3=84个fastq文件。

当然了,并不是每个10X样品都有84个fastq文件哈。甚至绝大多数情况下,就3个文件,如下所示:

5.6G 1月  21 10:29 YX-Endo-Decidu_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 44G 1月  21 10:33 YX-Endo-Decidu_S1_L001_R1_001.fastq.gz
118G 1月  21 10:44 YX-Endo-Decidu_S1_L001_R2_001.fastq.gz

2.6G 1月  21 10:44 YX-PBMC-Decidu_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 21G 1月  21 10:46 YX-PBMC-Decidu_S1_L001_R1_001.fastq.gz
 56G 1月  21 10:51 YX-PBMC-Decidu_S1_L001_R2_001.fastq.gz
 
2.3G 1月  21 12:31 ZZX-PBMC_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 17G 1月  21 12:32 ZZX-PBMC_S1_L001_R1_001.fastq.gz
 50G 1月  21 12:38 ZZX-PBMC_S1_L001_R2_001.fastq.gz
 
2.6G 1月  21 12:38 ZZX-yuan-2_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 19G 1月  21 12:40 ZZX-yuan-2_S1_L001_R1_001.fastq.gz
 56G 1月  21 12:46 ZZX-yuan-2_S1_L001_R2_001.fastq.gz

如上所示,可以看到每个样品都是3个文件,分别是 R1,R2,I1 这样的标记!

极端情况下,2个文件也OK,跑cellranger流程没有问题!

 14G 3月   1 16:19 test_L3_X37-1.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:41 test_L3_X37-1.R2.fastq.gz
 14G 3月   1 16:21 test_L3_X37-2.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:43 test_L3_X37-2.R2.fastq.gz
 14G 3月   1 16:24 test_L3_X37-3.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:37 test_L3_X37-3.R2.fastq.gz
 13G 3月   1 16:27 test_L3_X37-4.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:36 test_L3_X37-4.R2.fastq.gz

如下所示,一个样品其实就R1和R2两个文件,但是上面这个文件名并不是符合Cell Ranger流程哦,需要修改文件名!

现在,关于10X单细胞转录组原始测序数据,你懂了吗?

在2020的7月我看到了其更新到了V4,也里面写了一个总结,见:cellranger更新到4啦(全新使用教程),但是马上有升级了,目前是Cell Ranger - 5.0.1 (December 16, 2020),现在已经是V6,不过笔记其实是大同小异啦!

跑完了Cell Ranger仅仅是拿到了表达量矩阵文件而已,10x单细胞转录组数据的每个样品都有3个文件的表达矩阵,如下所示:

2.2M Mar  8  2019 GSM3660655_SC94IPFUP_barcodes.tsv.gz
259K Mar  8  2019 GSM3660655_SC94IPFUP_genes.tsv.gz
 26M Mar  8  2019 GSM3660655_SC94IPFUP_matrix.mtx.gz
 
2.2M Mar  8  2019 GSM3660656_SC95IPFLOW_barcodes.tsv.gz
259K Mar  8  2019 GSM3660656_SC95IPFLOW_genes.tsv.gz
 31M Mar  8  2019 GSM3660656_SC95IPFLOW_matrix.mtx.gz 

下游处理的时候,一定要保证这3个文件同时存在,而且在同一个文件夹下面。示例代码是:

rm(list=ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(Seurat)
sce1 <- CreateSeuratObject(Read10X('../10x-results/WT/'),
                          "wt")

重点就是 Read10X 函数读取 文件夹路径,比如:../10x-results/WT/ ,保证文件夹下面有3个文件。

后续分析需要一些基础认知,也可以看基础10讲:

明码标价

如果是你有自己的10X转录组原始测序数据,但是因为某些机缘巧合并没有跑Cell Ranger流程,所以你没有表达量矩阵文件。但是这样的Cell Ranger流程对服务器要求比较高,我们可以代劳哦!收费标准如下:

  • 3个样品以内是800元
  • 每增加3个样品为一个单位,增加800元
  • 赠送普通的降维聚类分群,参考前面的例子:人人都能学会的单细胞聚类分群注释
  • 提供全套数据和代码,使用最新流程和数据库文件

这个肯定是目前的网页工具无法满足的啦, 因为耗费计算机资源太大了,嘻嘻,而且呢,10X转录组原始测序数据一个样品就100G左右,所以一般来说推荐硬盘寄送哈!

老规矩,有需要的小伙伴们直接留言即可!

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