明码标价之10X转录组原始测序数据的cellranger流程

冷知识：其实一个10X单细胞转录组样品可以有多达84个fastq文件哦！

我们在单细胞天地多次分享过cellranger流程的笔记，大家可以自行前往学习，如下：

因为这个流程其实是需要10X单细胞转录组的fastq文件，而且呢，命名是有规则的！

如果你的样品被分散到了多个library、flowcell，就会出现一个样品有84个fastq文件的情况，恰好我看到了一个文献里面的数据就是这样的情况。该研究于2021年3月发表在《Nature Communications》杂志的文章， 标题是：《Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors》，链接是：https://www.nature.com/articles/s41467-021-21783-3

如下所示的一个样品，是SIGAA11， 足足有84个fastq文件，如下所示：

SIGAA11_S37_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S37_L009_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S38_L009_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S39_L009_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L003_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L003_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L003_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L004_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L004_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L004_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L005_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L005_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L005_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L006_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L006_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L006_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L007_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L007_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L007_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L008_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L008_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L008_I1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L009_R1_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L009_R2_001.fastq.gz
SIGAA11_S40_L009_I1_001.fastq.gz

如果你仔细观察这84个fastq文件的名字，就会发现规律，如果以下划线为分隔符，那么

• 第2列是S37到S40这4种情况
• 第3列是L003到L009这7种情况
• 第五列是R1，R1，I1这样的3种情况

总共就是 4x7x3=84个fastq文件。

当然了，并不是每个10X样品都有84个fastq文件哈。甚至绝大多数情况下，就3个文件，如下所示：

5.6G 1月  21 10:29 YX-Endo-Decidu_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 44G 1月  21 10:33 YX-Endo-Decidu_S1_L001_R1_001.fastq.gz
118G 1月  21 10:44 YX-Endo-Decidu_S1_L001_R2_001.fastq.gz

2.6G 1月  21 10:44 YX-PBMC-Decidu_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 21G 1月  21 10:46 YX-PBMC-Decidu_S1_L001_R1_001.fastq.gz
 56G 1月  21 10:51 YX-PBMC-Decidu_S1_L001_R2_001.fastq.gz
 
2.3G 1月  21 12:31 ZZX-PBMC_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 17G 1月  21 12:32 ZZX-PBMC_S1_L001_R1_001.fastq.gz
 50G 1月  21 12:38 ZZX-PBMC_S1_L001_R2_001.fastq.gz
 
2.6G 1月  21 12:38 ZZX-yuan-2_S1_L001_I1_001.fastq.gz
 19G 1月  21 12:40 ZZX-yuan-2_S1_L001_R1_001.fastq.gz
 56G 1月  21 12:46 ZZX-yuan-2_S1_L001_R2_001.fastq.gz

如上所示，可以看到每个样品都是3个文件，分别是 R1,R2,I1 这样的标记！

极端情况下，2个文件也OK，跑cellranger流程没有问题！

 14G 3月   1 16:19 test_L3_X37-1.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:41 test_L3_X37-1.R2.fastq.gz
 14G 3月   1 16:21 test_L3_X37-2.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:43 test_L3_X37-2.R2.fastq.gz
 14G 3月   1 16:24 test_L3_X37-3.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:37 test_L3_X37-3.R2.fastq.gz
 13G 3月   1 16:27 test_L3_X37-4.R1.fastq.gz
 11G 3月   1 16:36 test_L3_X37-4.R2.fastq.gz

如下所示，一个样品其实就R1和R2两个文件，但是上面这个文件名并不是符合Cell Ranger流程哦，需要修改文件名！

现在，关于10X单细胞转录组原始测序数据，你懂了吗？

在2020的7月我看到了其更新到了V4，也里面写了一个总结，见：cellranger更新到4啦（全新使用教程），但是马上有升级了，目前是Cell Ranger - 5.0.1 (December 16, 2020)，现在已经是V6，不过笔记其实是大同小异啦！

跑完了Cell Ranger仅仅是拿到了表达量矩阵文件而已，10x单细胞转录组数据的每个样品都有3个文件的表达矩阵，如下所示：

2.2M Mar  8  2019 GSM3660655_SC94IPFUP_barcodes.tsv.gz
259K Mar  8  2019 GSM3660655_SC94IPFUP_genes.tsv.gz
 26M Mar  8  2019 GSM3660655_SC94IPFUP_matrix.mtx.gz
 
2.2M Mar  8  2019 GSM3660656_SC95IPFLOW_barcodes.tsv.gz
259K Mar  8  2019 GSM3660656_SC95IPFLOW_genes.tsv.gz
 31M Mar  8  2019 GSM3660656_SC95IPFLOW_matrix.mtx.gz 

下游处理的时候，一定要保证这3个文件同时存在，而且在同一个文件夹下面。示例代码是：

rm(list=ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(Seurat)
sce1 <- CreateSeuratObject(Read10X('../10x-results/WT/'),
                          "wt")

重点就是 Read10X 函数读取 文件夹路径，比如：../10x-results/WT/ ，保证文件夹下面有3个文件。

后续分析需要一些基础认知，也可以看基础10讲：

明码标价

如果是你有自己的10X转录组原始测序数据，但是因为某些机缘巧合并没有跑Cell Ranger流程，所以你没有表达量矩阵文件。但是这样的Cell Ranger流程对服务器要求比较高，我们可以代劳哦！收费标准如下：

• 3个样品以内是800元
• 每增加3个样品为一个单位，增加800元
• 赠送普通的降维聚类分群，参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释
• 提供全套数据和代码，使用最新流程和数据库文件

这个肯定是目前的网页工具无法满足的啦， 因为耗费计算机资源太大了，嘻嘻，而且呢，10X转录组原始测序数据一个样品就100G左右，所以一般来说推荐硬盘寄送哈！

老规矩，有需要的小伙伴们直接留言即可！