【Neuron】当补体免疫系统遇上AD：一场“最漫长的告别”
阿尔兹海默病(Alzheimer's Disease, AD)是一种以老年斑和神经纤维缠结为主要病理特征的慢性中枢神经系统退行性疾病，临床上以认知能力下降与渐进性记忆力减退，并伴随着执行功能障碍以及人格异常等表现为主要特征，是老年痴呆中最常见的一种类型。Alzheimer's Disease International的报告显示，AD至少影响着全世界5000万人，每3秒钟就有一个新的AD病例发生在世界各地，到2050年，全球患有该病的人数将增加至1.315亿人。其高发病率成为人们普遍关心的重要问题之一。
AD发病机制非常复杂，表现为“多因异质性疾病”。随着研究的深入，研究人员在AD的发病过程中发现补体系统存在过度活化的现象。补体通路是先天免疫的关键调控因子，经典激活途径的活化阶段需要C3补体被裂解成C3a和C3b两个片段，C3b分别通过与受体C3aR和CR3结合而引发下游事件。补体通路分子在中枢神经系统中表达，参与衰老和疾病发病过程。目前，脑内补体激活途径参与AD的发病机制大部分集中在Aβ相关机制的研究上，但其在tau蛋白病理方面的作用机制尚不清楚。
2018年11月8日,《Neuron》杂志在线刊登了贝勒医学院郑辉教授团队的最新研究工作[1]，他们发现了C3a受体(C3aR1)相关的神经免疫信号网络影响tau蛋白磷酸化在AD发病机制中的作用，为AD提供新的潜在免疫治疗靶点，提高了人们在该领域的认知。
郑辉教授
结果
阿尔兹海默病
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C3和C3aR1的表达与AD表型相关
首先，他们用RNA-seq数据分析了海马旁回C3和C3aR1的表达情况，发现在无认知功能障碍（NCI）、轻度认知功能障碍（MCI）和痴呆（Dementia）的三个时期C3和C3aR1的表达量逐渐增高（图1A、1B），这与Braak分期中tau蛋白病理程度有关（图1C、1D）。同时， qPCR分析发现其他几类tau相关疾病（如匹克氏病等）中的C3和C3aR1的mRNA水平也有很高的表达量（图1E、1F）。
随后，作者在PS19 tau转基因小鼠上做进一步验证，结果显示PS19小鼠体内C3和C3ar1的mRNA水平在第6个月时极显著上升（图1G、1H），这与C3蛋白水平的升高有关（图1I）。研究还发现，PS19小鼠体内增加的C3aR受体主要来自于小胶质细胞（图1J、1K）。这些数据提示了C3和C3aR在人类tau相关疾病及其小鼠模型中被激活。
图1 AD和Tau病患者中C3和C3aR表达上调
2
C3ar1基因缺失减轻PS19小鼠的神经炎症
接下来，作者验证了C3-C3aR信号在免疫调节和tau发病机制中的作用。他们发现，PS19小鼠中星形胶质细胞（GFAP阳性）和小胶质细胞（Iba1阳性）的数量显著增多（图2A-C）。同时，补体C3在PS19小鼠星形胶质细胞中的表达急剧增加。然而，C3ar1基因敲除的PS19鼠中上述现象不复存在（图2D、2E），且Iba1阳性的小胶质细胞中CD68强度明显减弱(图2G)，这提示了C3-C3aR信号会影响星形胶质细胞的增殖和小胶质细胞吞噬作用。
有意思的是，C3ar1基因敲除的PS19鼠中，数个炎症因子（TNFα、IL6、IL1β）的含量不再增加（图2I-K，PS19鼠的炎症因子升高）。这些结果支持了C3aR调控星形胶质细胞和小胶质细胞反应性，这是PS19 AD小鼠模型产生促炎因子的前提。
图2 C3ar1基因缺失减轻PS19小鼠的神经炎症
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C3ar1基因缺失改善PS19小鼠神经功能
以上研究证实了C3aR在免疫调节中的重要作用。接下来他们试图了解C3aR功能缺失对tau蛋白病理程度和神经元功能的影响。
Western blot和免疫组织染色结果显示，C3ar1缺失可以显著改善高度磷酸化的tau蛋白，但对tau蛋白总量无显著影响（图3A-D）。行为水平上发现，沉默C3aR蛋白（C3aR KO）可以改善海马依赖性记忆损伤和LTP诱导作用（图3E、3F）。这些数据表明，C3ar1基因缺失对PS19小鼠的突触可塑性和认知功能障碍具有改善作用。
图3 C3ar1缺失降低了PS19小鼠高度磷酸化tau蛋白并改善其行为缺陷
随后，作者还对C3aR丢失后的功能恢复情况进行验证，他们利用成像技术发现PS19小鼠海马CA3区突触素（Syp）强度及神经元数目均显著降低，而C3ar1缺失则可以恢复突触丢失的现象并有效逆转神经变性（图4）。
图4 C3ar1基因的缺失改善了PS19小鼠的突触丢失和神经变性
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C3aR调控AD和PS19小鼠的免疫网络表达接下来，作者在基因层面进行分析比较，结果显示人类数据集和小鼠C3aR控制的基因网络具有高度一致性，C3-C3aR信号通路可能通过引发炎症反应、激活免疫细胞促进AD的发病（图5）。
图5 C3aR调控AD患者和PS19小鼠的免疫网络表达
此外，研究还发现，C3aR可以通过调控PS19小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞基因表达谱来发挥免疫功能（图6A-E）。随后，作者进一步检测了C3aR调控关键转录因子（TFs）的表达情况（图6F），结果显示，小胶质细胞在介导C3aR下游的转录变化中起主要作用（图6G-H）。
图6 C3aR信号通路激活PS19小鼠炎症反应和小胶质细胞增殖转录因子
5
C3-C3aR诱导STAT3信号通路机制
上述研究发现，STAT3可能是C3aR的特定靶点，为进一步验证，作者利用反相蛋白阵列(RPPA)平台和Western blot分析证实了STAT3、pSTAT3是PS19小鼠中候选上调蛋白，随后被C3aR KO逆转(图7A-E)。他们分别用IL6或C3处理BV2细胞使其过表达C3aR，检测结果显示，C3诱导STAT3磷酸化和核易位，用C3aR拮抗剂（C3aRA）处理后可以有效地逆转这一现象（图7F-H）。深入研究发现，C3-C3aR可以直接调控pSTAT3及其下游信号，与STAT3磷酸化及其激活有关（图7I-L）。
图7 C3-C3aR直接调控STAT3磷酸化及信号转导
通过C3-C3aR信号可以直接调控pSTAT3活性，提示了pSTAT3可能是C3aR下游功能发挥作用的前提。因此，抑制PS19小鼠中的pSTAT3可能与上述C3aR沉默的结果类似。他们用SH-4-54（SH，STAT3磷酸化位点抑制剂，可过血脑屏障）处理PS19小鼠。结果显示，经过SH处理后的PS小鼠中pSTAT3水平、星形胶质细胞、小胶质细胞及炎症因子均显著降低（图8）。
综上，这些数据提示了抑制pSTAT3可以缓解tau蛋白病理程度及神经炎症反应。
图8 STAT3抑制剂可以减轻衰老PS19小鼠中tau病理程度和神经炎症反应
随着AD发病率的逐年上升，其发病机制的研究及治疗靶点已经成为医学界广泛关注的老年病热点问题。郑辉教授团队的研究发现C3-C3aR在调节中枢神经系统免疫稳态和tau蛋白病理方面发挥关键作用，保守的C3aR网络和STAT3激活的补体信号之间的联系有望成为未来治疗AD的新药物靶点。
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参考文献
[1] Litvinchuk et al. Complement C3aR Inactivation Attenuates Tau Pathology and Reverses an Immune Network Deregulated in Tauopathy Models and Alzheimer’s Disease[J]. Neuron, 2018. DOI:https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.10.031.