科学新发现：克服“全民焦虑症”！韩峰团队揭示调控焦虑行为的新机制
焦虑现成为了我们日常生活的一部分，是最常体验到的一种情绪，通常只持续短时间。然而如果一个人极度焦虑而影响到日常生活，那么，他很有可能被诊断为焦虑症（anxiety disorder），这是明显感觉焦虑和恐惧感的一种精神疾病。对于患有焦虑症的人来说，焦虑不会消失，而且随着时间的推移会变得更糟。
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有研究发现，基底外侧杏仁核(BLA)是调节焦虑相关行为神经回路的一个关键组成部分[1]，BLA锥体神经元对神经元活化的敏感性是决定生物体情绪和焦虑状态的重要因素[2]。然而，其具体机制仍未知。南京医科大学韩峰教授课题组与卢应梅教授、浙江大学陈忠教授合作的最新研究发现TMEM74通过影响BLA神经元HCN1离子通道调控焦虑行为的神经机制，这一重要成果发表在近期的《Molecular Psychiatry》杂志上[3]。
TMEM74 是一种溶酶体跨膜分子，可诱导细胞自噬，在其C-端附近包含两个跨膜结构域：TM1和TM2 [4]。有研究发现，在人脑组织中，TMEM74的RNA表达水平尤其高。
HCN（超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道）基因家族，至少包含HCN1-HCN4四个成员[5]，HCN通道可以调节BLA投射神经元的动作电位(AP)，在精神疾病(如焦虑症)的发病机制中发挥着重要作用[6]。
焦虑样行为导致Tmem74表达降低
首先，作者通过WB分析发现，与年龄相似的健康对照组相比，广泛焦虑症患者TMEM74表达水平显著降低（图1a,1b）。随后，他们对一组野生型小鼠进行慢性束缚应激（CIS）刺激（图1c），高架十字迷宫（EPM）行为学实验结果发现，CIS小鼠进入开放臂的次数及停留时间均显著减少（图1d-f），同时，其Tmem74表达水平也明显减低（图1g-j）。
随后，作者在小鼠BLA区注射AAV-CaMKIIα-eGFP-2A-Tmem74-3FLAG病毒，四周后给予CIS刺激（图1k,1i），EPM结果发现，与注射对照病毒的CIS小鼠相比，注射AAV-Tmem74病毒的CIS小鼠进入进入开放臂的次数及停留时间均显著增加（图1m-o）。同时，矿场实验（OFT）也得到了类似的结论（图1p,q）。这提示了Tmem74过表达可以有效改善CIS诱导的焦虑样行为。
图1 焦虑样行为导致Tmem74表达降低
Tmem74缺失导致焦虑行为
为进一步研究Tmem74在焦虑障碍中的作用，科研人员借助TALEN技术构建Tmem74-/-模型鼠，随后，通过一系列行为学实验发现，Tmem74缺失导致小鼠焦虑样行为的增加，但不影响小鼠的运动及学习记忆能力（图2a-g）。随后，作者同样在Tmem74-/-模型鼠BLA区注射AAV-CaMKIIα-eGFP-2A-Tmem74-3FLAG病毒，OFT和高架zero迷宫（EZM）结果发现，在BLA锥体神经元中过表达Tmem74同样可以有效改善Tmem74-/-模型鼠的焦虑样行为（图2k-n）。
图2 Tmem74-/-模型鼠表现为焦虑样行为增加
此外，作者借助CRISPR/Cas9技术进一步验证，他们在Cas9小鼠BLA区注射AAV-U6-sgTmem74-CaMKIIα-Cre病毒（图3a,3b），OFT和EZM行为学实验发现，选择性敲除BLA锥体神经元中Tmem74导致小鼠焦虑行为增加（图3d-g）。这些结果提示了Tmem74缺失可导致焦虑。
图3 选择性敲除BLA锥体神经元中Tmem74导致小鼠焦虑行为增加
敲除Tmem74可提高BLA锥体神经元的兴奋性
接下来，作者发现Tmem74-/-模型鼠BLA锥体神经元中c-Fos基因表达上调（图4a,4b）。随后，他们用生物胞素标记技术结合全细胞记录BLA锥体神经元的放电特性（图4c,4d），数据显示，敲除Tmem74可提高BLA锥体神经元兴奋性（图4e-j）。此外，借助AAV病毒过表达Tmem74后，Tmem74-/-模型鼠BLA锥体神经元兴奋性受到抑制（图4k-q）。
图4 Tmem74-/-模型鼠BLA锥体神经元兴奋性
Tmem74调控HCN1功能参与焦虑病理过程
基于超极化激活的阳离子通道（Ih）电流的变化可改变动作电位（AP）发放频率[7]、输入电阻[8]及神经元兴奋性[9]。作者借助全细胞膜片钳记录方法观察了BLA锥体神经元Ih去极化下凹（depolarizing sag）及电流变化。结果发现，与Tmem74-/-模型鼠相比，野生型小鼠BLA锥体神经元表现出明显的去极化电压下凹（图5a,5b）。同时，他们还分析了小鼠BLA中HCN1-HCN3（超极化激活环核苷酸门控阳离子通道）蛋白水平，发现Tmem74-/-雄性模型鼠HCN1所表达的Ih电流明显下降（图5e）。这些数据提示了HCN1通道功能损伤可能与Tmem74-/-模型鼠焦虑行为有关。AAV病毒过表达Tmem74后，HCN通道功能得到改善（图5h-m）。
为进一步研究HCN通道功能损伤与Tmem74-/-模型鼠BLA锥体神经元兴奋性关系。他们加入ZD7288（HCN阻断剂）后，发现野生型小鼠BLA锥体神经元兴奋性显著增加，其放电类型与Tmem74-/-模型鼠锥体神经元一致（图5n,o）。此外，加入ZD7288后，这两种小鼠神经元输入电阻的差异消失（图5p）。这些数据表明HCN通道功能受损导致Tmem74-/-模型鼠神经元兴奋性增加。
图5 HCN通道功能受损导致Tmem74-/-模型鼠神经元兴奋性增加
最后，他们研究了Tmem74缺失导致HCN通道功能损伤的分子机制。作者用WB等分子生物学技术发现Tmem74与HCN1蛋白存在直接相互作用（图6a-d）。随后，借助质粒共转染结合全细胞记录发现，跨膜结构域TM1在调控HCN1功能方面发挥重要作用（图5e-g）。
图6 Tmem74-HCN1相互作用调控 Ih电流变化
结论：
焦虑症是一类严重危害人类健康的高发性的精神疾病。本文基于临床焦虑病人血清样本，筛选出跨膜蛋白TMEM74，通过行为学、基因操作、TALEN技术、CRISPR/Cas9技术、电生理等方法揭示了Tmem74通过其TM1结构域调控BLA神经元HCN1功能参与焦虑病理过程的分子机制，为研究临床治疗焦虑的药物提供新靶点。
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参考文献：
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[2] Pidoplichko VI, Aroniadou-Anderjaska V, Prager EM, Figueiredo TH, Almeida Suhett CP, Miller SL, et al. ASIC1a activation enhances inhibition in the basolateral amygdala and reduces anxiety. J Neurosci. 2014;34:3130–41.
[3] Han F, et al. Functional coupling of Tmem74 and HCN1 channels regulates anxiety-like behavior in BLA neurons. Molecular Psychiatry 2019; Mar 18. doi: 10.1038/s41380-019-0402-8.
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[8] Sun Z, Williams DJ, Xu B, Gogos JA. Altered function and maturation of primary cortical neurons from a 22q11.2 deletion mouse model of schizophrenia. Transl Psychiatry. 2018;8:85.
[9] Sun Z, Williams DJ, Xu B, Gogos JA. Altered function and maturation of primary cortical neurons from a 22q11.2 deletion mouse model of schizophrenia. Transl Psychiatry. 2018;8:85.