Nature Communications：调控外泌体分泌的重要基因被发现
外泌体是一种大小为30-150nm的纳米囊泡，它能参与各种胞外功能，比如免疫功能、代谢调节、肿瘤转移和神经退行性疾病等[1-2]。有文献报道，一些转运蛋白（如HRS和Tsg101）、脂质（如神经酰胺）、四联体蛋白家族（如CD81和CD9）、Rab GTPases（如Rab11, Rab27, and Rab35）能调节外泌体的分泌[3-4]，但是外泌体分泌的上游调节机制目前还不清楚。
KIBRA主要在肾脏和与记忆相关的大脑区域表达，在这些区域中，KIBRA作为支架蛋白参与细胞的各种过程，如细胞极性、细胞迁移和细胞膜转运[5-6]。研究表明，KIBRA对海马信号通路、突触可塑性、学习、早期胞内体运输等有重要调节作用[7]。然而，KIBRA在调节外泌体或细胞外囊泡（EV）分泌方面的潜在作用尚不可知。
来自山东大学附属省立医院杜怡峰课题组于2019年4月9日在《Nature Communications》中发表了关于外泌体文章，文中阐述KIBRA对于外泌体分泌具有重要作用，且通过抑制Rab27a的蛋白酶体降解来控制外泌体的分泌[8]。
杜怡峰教授
KIBRA在体外调节EVs的分泌
由于KIBRA主要在肾脏和脑部表达，作者选了小鼠海马神经元细胞系（HT22）和小鼠肾足突细胞系（MPC5）进行体外实验。为了分析KIBRA对不同亚型EVs分泌的影响，作者在细胞系中分别敲低或过表达KIBRA，用无外泌体血清培养细胞48h，再通过不同的转速（2000*g、10000*g、100000*g）分离EVs。作者发现相比于对照组，敲低了KIBRA的HT22细胞系，其胞内总蛋白量变化不大，但其分泌的外泌体内蛋白量明显下降。用外泌体marker（Alix、Tsg101、CD63、CD9）蛋白水平变化进一步验证，HT22中敲低KIBRA破坏了EVs的分泌，尤其是外泌体的分泌。NTA和电子显微镜的结果也显示了超离得到的EVs大小大多数与外泌体大小相符。此外，HT22中过表达KIBRA会明显促进细胞的外泌体分泌，而不影响外泌体的大小和形态。同样，MPC5中敲低或过表达KIBRA后外泌体的蛋白水平变化与HT22中一致（图1）。
图1 KIBRA体外调节胞外小囊泡（EVs）的分泌
敲低KIBRA增加了多泡体（MVBs）的大小和数量
为了进一步分析敲低KIBRA破坏外泌体分泌的机制，作者用电子显微镜观察管腔内囊泡（ILVs）和MVBs的数量和形态。实验发现，敲低KIBRA虽然明显降低了外泌体的分泌，但导致了细胞中MVBs和MVBs内ILVs的积累。同时，ILVs的形态没有发生任何变化，表明了KIBRA可能仅影响外泌体的分泌，而不影响它的生成。
随后作者用CD63作为免疫荧光marker，进一步研究MVBs的亚细胞分布。结果发现，敲低KIBRA会引起细胞中CD63的大量分布，即每个细胞中CD63+斑点的大小和数量都有所增加。WB也显示CD63表达水平的增加，约为对照组的三倍。
有报道称外泌体分泌可能与自噬直接相关[9-10]，但是在本次实验中WB和免疫荧光检测结果均没有显示LC3B（自噬体标记物）和Lamp2（溶酶体标记物）水平有明显变化（图2）。
图2 敲低KIBRA增加了MVBs的大小和数量
KIBRA在体内调节外泌体分泌
作者利用蔗糖密度梯度离心分别从KIBRA敲除小鼠和WT小鼠的大脑和肾脏的胞外空间中分离纯化外泌体。结果发现，外泌体标记物CD9和CD63主要存在于蔗糖梯度的b-e部分，而内质网蛋白Calnexin在蔗糖梯度中没有被发现，同时WB结果显示相对于WT小鼠胞外外泌体的CD9和CD63含量，KIBRA敲除小鼠外泌体的CD9和CD63含量降低了。NTA结果表明KIBRA敲除小鼠分泌的外泌体数量只有WT小鼠的52%，但是外泌体的平均大小没有受影响。这些数据表明在KIBRA敲除小鼠中外周血外泌体的分泌遭到破坏。
此外，电子显微镜的结果也显示在KIBRA敲除小鼠中细胞内的MVBs数目和ILVs数目都明显增加，这些数据验证了KIBRA在体内调控外泌体分泌和MVBs表型的作用（图3）。
图3 KIBRA在体外调节外泌体分泌和MVB表型
敲除KIBRA促进了Rab27a的降解
作者通过质谱（MS）分析和同位素标记相对与绝对定量（iTRAQ）技术筛选了KIBRA敲除小鼠大脑与WT幼鼠之间差异表达的蛋白质。结果发现Rab27a在所有有统计学意义（P<0.05）的蛋白中变化最显著的蛋白。
为了进一步验证蛋白质谱，我们比较了KIBRA敲除小鼠和WT小鼠的皮层和海马中Rab27a的水平。结果表明KIBRA敲除导致了皮层和海马区域中Rab27a表达水平的显著下降。WB分析显示Rab27a在KIBRA敲除小鼠的皮层、海马、肾脏、肌肉和肝脏中表达明显降低，但是qPCR结果是Rab27a的mRNA水平在KIBRA敲除小鼠的肾脏、肌肉和肝脏中没有变化，但在皮层和海马中表达提高了，这可能是由于Rab27a蛋白的过度降解引起的补偿机制。因此，作者认为KIBRA敲除小鼠中Rab27a蛋白水平的降低是由于降解增加而不是Rab27a的合成减少引起的（图4）。
图4 敲除KIBRA促进了Rab27a的降解
KIBRA能防止Rab27a被泛素化
为了探索KIBRA的降解机制，作者分别将KIBRA敲低细胞和对照组细胞用蛋白质合成抑制剂（环己酰亚胺（CHX））、蛋白酶体抑制剂（Lac）或溶酶体抑制剂（Baf）进行处理。WB分析显示，当用CHX处理12小时时，Rab27a大大降解，并且这种降解可以通过蛋白酶体抑制剂Lac而不是通过溶酶体抑制剂Baf恢复。同时，IP实验表明KIBRA被敲低后，Rab27a更容易被泛素化。因此，这些结果验证了Rab27a主要通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。
随后通过cross-IP和免疫荧光实验得出Rab27a和KIBRA之间是直接相互作用。Rab27a通过与KIBRA相互作用后变得更加稳定，从而不被泛素化。相反，KIBRA敲低导致Rab27a的蛋白酶体降解增加，这反过来抑制了外泌体的分泌（图5）。
图5 KIBRA使得Rab27a更加稳定并防止其泛素化
过表达Rab27a能修复被破坏的外泌体分泌
为了进一步探讨KIBRA是否通过Rab27a调节外泌体分泌，作者将过表达Rab27a质粒转染入Rab27a敲低细胞和对照组细胞，再通过G418进行抗性筛选。实验结果表明，与上述结果一致，相比于对照组，KIBRA敲低细胞的外泌体蛋白总量明显减少，但是过表达Rab27a后，外泌体内蛋白水平显著提高。随后通过对外泌体标记物（Alix、Hsc70、Tsg101）进行验证，显示相似的实验结果。这些数据表明过表达Rab27a能修复被破坏的外泌体分泌过程（图6）。
图6 过表达Rab27a能修复由于KIBRA基因敲低引起的外泌体分泌被破坏的过程
本文主要阐释了Rab27a通过与KIBRA相互作用而变得更加稳定，这就阻止了Rab27a通过泛素-蛋白酶体途径被泛素化和降解，同时Rab27a本身可以在体内和体外调控外泌体的分泌，所以作者得出KIBRA可以通过抑制Rab27a的蛋白酶体降解来控制外泌体分泌的结论。
和元上海一直致力于外泌体相关项目研究，可以为研究人员提供外泌体超速离心分离、透射电镜拍摄、纳米粒径分析、WB分子标志物检测和高通量测序/芯片等整体解决方案，实验周期短、价格优惠、项目经验丰富。欢迎随时来咨询实验思路和方案!021-31601005 ，400-151-5198
本内容版权归和元上海所有
如需转载请在文章留言区申请转载
未经授权不得以转载或其他任何形式使用
[1] Raposo, G. & Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J. Cell Biol. 200, 373-383 (2013).
[2] Sarko, D. K. & McKinney, C. E. Exosomes: origins and therapeutic potential for neurodegenerative disease. Front. Neurosci. 11, 82 (2017).
[3] Colombo, M. et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. J. Cell. Sci. 126, 5553-5565 (2013).
[4] Ostrowski, M. et al. Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway. Nat. Cell Biol. 12, 19-30 (2010).
[5] Meliambro, K. et al. The Hippo pathway regulator KIBRA promotes podocyte injury by inhibiting YAP signaling and disrupting actin cytoskeletal dynamics. J. Biol. Chem. 292, 21137-21148 (2017).
[6] Duning, K. et al. KIBRA modulates directional migration of podocytes. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 1891-1903 (2008).
[7] Makuch, L. et al. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
[8] Song, L. et al. KIBRA controls exosome secretion via inhibiting the proteasomal degradation of Rab27a. Nat Commun. 10, 1639 (2019).
[9]Baixauli,F.etal. Exosomes and autophagy: coordinated mechanisms for the maintenance of cellular fitness. Front. Immunol. 5, 403 (2014).
[10] Ojha, C. R. et al. Interplay between autophagy, exosomes and HIV-1 associated neurological disorders: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Viruses 9, E176 (2017).