Tau蛋白如何影响记忆？王建枝、刘恭平合作研究揭示阿尔茨海默病的潜在临床治疗靶点
当你老了，大脑出问题了，记忆消失了，该如何面对接下来的人生，我们又该如何面对他们。。。
这是最近一档关于阿尔兹海默症的公益节目---《忘不了餐厅》开头抛给我们的问题，节目的热播，将阿尔兹海默症患者的日常生活真实地、多角度地展现给观众，引发了大众的热议，使人们更多的关注这个疾病。
在中国，平均每天有超过1000位老人走失，每10个老人中就有一个认知障碍患者，其中超过半数患者有阿尔茨海默病。
阿尔兹海默症 (Alzheimer's disease, AD) 是一种与年龄有关的慢性中枢性神经退行性疾病，临床上以认知能力下降与渐进性记忆力减退，并伴随着执行功能障碍以及人格异常等表现为主要特征[1]。
老年斑(Senile plaques, SPs)、神经纤维缠结 (Neurofibrillary tangles, NFTs)是AD两大主要的病理特征，聚集在细胞内部的NFTs是由tau蛋白过度磷酸化造成的[2]。tau蛋白是一种神经元微管相关蛋白质，具有稳定微管网状结构的功能，广泛存在于神经细胞中，主要分布于中枢和周围神经系统神经细胞的轴突中[3,4]。
tau蛋白异常磷酸化学说认为，AD患者脑内的tau蛋白高度磷酸化，易于聚集，从而形成NFTs，与突触后蛋白相互作用，导致神经元微管破坏，胞体－轴突营养物质运输及突触功能障碍，严重影响神经细胞的正常功能，最终导致细胞骨架和胞浆代谢的紊乱，神经元退化死亡[5,6]。但Tau蛋白聚集如何引起突触功能障碍和记忆损伤的机制仍不清楚。
来自华中科技大学同济医学院基础医学院刘恭平、王建枝教授团队发现胞内hTau蛋白聚积可通过JAK2/STAT1信号通路抑制NMDAR表达，进而导致突触和记忆受损。而下调STAT1可有效改善hTau介导的突触功能障碍和记忆损伤现象。这一重要成果发表在2019年5月13号的《EMBO Reports》上[7]。
结果
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胞内hTau蛋白聚积诱导STAT1活化
首先，作者通过全基因组mRNA芯片筛选和生物素标记DNA探针发现，在过表达hTau的细胞中，STAT1转录活性显著上调，随后，借助分子手段、免疫荧光及TF荧光素酶分析均发现，过表达hTau可以显著增加STAT1在Tyr701 位点的磷酸化（pY-STAT1）。即体外验证了细胞内hTau聚积可诱导STAT1活化（图1）。
图1 体外过表达hTau激活STAT1及其核易位
随后，作者在体内进一步验证。借助AAV病毒载体，他们在小鼠海马过表达hTau，1个月后检测STAT1和pY-STAT1的变化。结果显示，hTau的过表达显著增加了海马组织总蛋白和核蛋白内的STAT1和pY-STAT1的表达，且STAT1 mRNA水平也升高（图2A,B,J）。同时，在hTau转基因小鼠海马及AD病人的临床样本中也发现了类似的现象（图2C-G）。
图2 体内过表达hTau上调STAT1磷酸化
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下调STAT1可以改善hTau诱导的记忆缺陷和突触功能障碍
有研究发现，Tau蛋白在小鼠海马CA3中的积累会导致空间学习和记忆缺陷[8]，为研究STAT1在hTau诱导的记忆损伤中的作用，他们将AAV-hTau和AAV-Cre混合病毒双侧注射STAT1flox/flox小鼠海马CA3区，条件性敲除STAT1。Western blotting和免疫检测发现AAV-Cre可以有效下调STAT1水平（图3A,B），Morris水迷宫测试实验结果显示，这三组小鼠的游泳速度无明显差异，但STAT1敲除组小鼠的逃逸潜伏期和空间探索实验过程中的潜伏期均显著下降，且表现出更长时间、更频繁的穿越原平台所在象限的行为（3D-G），这提示了下调STAT1可有效逆转由hTau诱导的小鼠空间学习障碍。此外，情景条件恐惧测试实验结果也发现STAT1下调可以提高小鼠的长期记忆（图3H），这些结果提示了，下调海马区STAT1可以有效改善hTau诱导的小鼠学习记忆障碍。
随后，作者继续对突触可塑性进行研究，他们借助电生理手段，发现注射AAV-hTau和AAV-GFP的小鼠双脉冲比值（PPR）无显著性差异（图3I），提示了过表达hTau不影响突触前功能障碍。然而，输入/输出（I/O）曲线显示hTau抑制了基底突触传递，兴奋性突触后电位（fEPSP）在hTau表达的脑切片中的斜率降低，而下调STAT1可以显著减弱hTau对突触传递的长时程增强（LTP）的抑制作用（图3J-L）。这提示了hTau蛋白通过影响突触后机制抑制LTP，而STAT1的下调可以改善hTau诱导的突触传递被抑制的现象。
借助全细胞膜片钳技术，作者记录了急性海马脑切片DG-CA3突触上的NMDA和AMPA受体介导的突触反应。发现在hTau过表达小鼠中NMDAR受体介导的突触反应显著下降，而STAT1下调可以逆转这一现象（图3M-P）。
图3 下调STAT1可改善hTau诱导的认知和突触损伤
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STAT1通过与启动子的特定区域结合抑制NMDAR表达
进一步，作者探究了hTau介导的STAT1活性上调是如何影响突触功能的。Western blotting和PT-PCR结果发现，hTau可诱发突触相关蛋白NMDARs的蛋白表达和mRNA水平升高，而用AAV-Cre配合STAT1flox/flox鼠策略条件性敲除STAT1则能有效地逆转这一现象（图4）。
图4 hTau聚积通过上调STAT1抑制NMDARs表达
随后，科研人员在转录因子数据库中筛选了STAT1在GluN1、GluN2A、GluN2B启动子区域的潜在结合位点[9]。他们在STAT1结合GluN1和GluN2B的启动子区域发现了两个保守的干扰素γ活化序列（GAS），在GluN2A启动子区域发现了四个GAS序列（图5C,E,G）。染色质免疫沉淀（ChIP）研究表明过表达海马区hTau后可显著增加STAT1与GluN1、GluN2B和GluN2A启动子区的结合，且上调STAT1可抑制NMDARs的转录活性（图5A,B）。这些数据提示了激活STAT1可通过直接结合NMDARs启动区来抑制NMDAR的表达。
为研究结合的特异性，作者用荧光素酶报告基因发现STAT1分别通过结合GAS1和GAS2序列来抑制GluN1和GluN2B的表达（图5C-F）。而对于GluN2A启动子区域的四个GAS序列，发现STAT1只有与GAS3共表达可诱导转录活性，并被GAS3突变体所抑制（图5G,H）。进一步研究发现，STAT1与GAS1-3、GAS2-4、GAS3-4共表达均能抑制荧光素酶活性，而与GAS2-3共表达则能提高荧光素酶活性（图5I,J），提示了STAT1与GluN2A作用可能依赖于多个GASs序列。
图5 hTau聚积增加STAT1与NMDAR启动子的结合，抑制NMDARs的表达
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抑制STAT1磷酸化可以改善hTau诱导的突触和记忆损伤
STAT1的磷酸化是其核易位和活化的关键[10]。因此，为了进一步找到调控hTau诱导STAT1活化的上游因子，作者筛选了能够磷酸化STAT1的蛋白激酶[11]，发现过表达hTau可激活JAK2、JNK和ERK，但是只有抑制JAK2时，会导致hTau诱导的STAT1在pY401位点高度磷酸化被抑制（图6A-J）。且在12月龄的hTau转基因小鼠和注射AAV-CMV-hTau或AAV-Syn-hTau的小鼠海马中也检测到JAK2的激活（图6K,J）。表明了hTau积累通过激活JAK2上调STAT1的活性。
图6 JAK2活化调控hTau诱导的STAT1活化
最后，作者探究了STAT1磷酸化在调节NMDARs的表达和认知能力中的作用。他们构建了非磷酸化的STAT1显性失活突变体（AAV-Y701F-STAT1），并与AAV-hTau混合注射3月龄小鼠海马CA3区（图7A），发现Y701F-STAT1显性失活突变可改善hTau对LTP的抑制作用及hTau导致的学习记忆障碍，并恢复GluN1、GluN2A和GluN2B蛋白和mRNA水平（图7B-L）。这些数据表明，STAT1在Tyr701位点的磷酸化在hTau诱导的突触和记忆损伤中发挥了重要作用。
图7 抑制STAT1激活可以挽救htau诱导的突触和记忆损伤
结论：
文中作者借助全基因组mRNA芯片、转录因子活性筛选、分子手段及病毒载体介导的过表达和条件性敲除等技术发现胞内hTau蛋白聚积可通过JAK2/STAT1信号通路抑制NMDAR表达，进而导致突触功能障碍和学习记忆受损。揭示了hTau诱发突触损伤和记忆缺失的新机制，为AD的药物开发提供新的治疗靶点
文中借助AAV病毒载体实现的过表达和条件性敲除已广泛用于体内的基因操作，和元上海有幸提供实验中使用的AAV病毒（AAV-hTau、AAV-EGFP，AAV-Cre，AAV-Y701F-STAT1），用实际行动助力中国脑科学的发展。
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参考文献：
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