【Science】新知！岛叶-杏仁核不同环路编码恐惧学习与恐惧记忆

在上周的文章里我们讲到，由于模式动物小鼠没有能力像我们人类一样通过语言、动作等方式表达自己的场景记忆，科研工作者便引入条件恐惧范式以通过恐惧行为表征小鼠的场景记忆。本篇文章中，我们继续使用条件恐惧范式，借以探究恐惧学习与恐惧记忆的神经环路机制。 

条件恐惧范式

图片来源：IntechOpen

上图便是条件恐惧范式的经典模型[1]：将一个无害的条件刺激（Conditioned stimulus, CS, 例如：一段声音）与另一个伤害性非条件刺激刺激（Unconditioned stimulus, US, 例如：足底电击）相偶联，在恐惧学习之后，当再度接触CS时，哪怕无US，小鼠也会表现出恐惧性颤栗[2]。一段时间之后，小鼠会继续对CS产生恐惧，我们称之为恐惧记忆。所谓一朝被蛇咬，十年怕井绳，便是一个经典的条件恐惧范式，其中咬人的蛇是US，形状像蛇一样的草绳是CS，被咬的经历是恐惧学习，十年的害怕则是恐惧记忆。 

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过去的研究表明，恐惧学习主要由外侧杏仁核（Lateral amygdala, LA）所编码，在LA中CS与US得以偶联[3]。当CS为一段声音、US为足底电击时，听觉信息经由听皮层与丘脑传递到LA中[4]，但是足底电击引起的厌恶性感觉信息如何传递到LA，我们尚未可知。 

大脑杏仁核

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其他研究表明，岛叶皮层（Insular cortex）调控多种感觉信息，包括内脏[5]、味觉[6]、躯体感觉[7]与听觉[8]。脑功能成像研究显示，人类的岛叶皮层会被痛觉刺激激活[9]，岛叶皮层损伤的卒中患者经历痛觉刺激时不产生厌恶性情绪[10]。然而，在恐惧学习的过程中，岛叶皮层是否将厌恶性躯体感觉信息传递至LA，我们同样未能知晓。

岛叶皮层

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2019年5月31日，《Science》杂志在线刊登了瑞士洛桑联邦理工学院Ralf Schneggenburger教授的最新重要工作[11]，他们发现后岛叶皮层神经元参与恐惧学习过程中小鼠对声音刺激以及足底电击刺激的反应。此外，这些神经元可分为两个亚群，分别投射到杏仁核不同亚区，编码不同功能。该研究首次揭示了岛叶-杏仁核编码恐惧学习与恐惧记忆的神经环路机制，极大提高了我们在恐惧情绪相关领域的认知。 

Ralf Schneggenburger教授

图片来源：洛桑联邦理工学院

结果

1.抑制后岛叶皮层影响恐惧学习过程 

首先，允许笔者在这里吐槽一下。文章背景部分中讲述的都是岛叶皮层的相关功能，而结果部分中一开始便讲后岛叶皮层，无任何过渡内容。说句实话，对文章非领域内读者不太友好。于是乎，我们姑且认为后岛叶皮层参与厌恶性躯体感觉相关信息的编码。

为研究后岛叶皮层是否参与恐惧学习过程，作者引入条件恐惧范式，以声音作为CS，足底电击作为US（图1A）。他们在小鼠后岛叶皮层中双侧注射AAV-hSyn-eNpHR3.0并植入光纤（图1B, E），4周后在US过程中给予黄光抑制后岛叶神经元，发现与对照组相比，实验组小鼠训练过程中颤栗行为显著减少，后一天颤栗行为也减少（图1C-D），表明后岛叶皮层参与恐惧学习过程。

图1 抑制后岛叶皮层影响恐惧学习过程

2.后岛叶皮层与LA、CeA形成兴奋性突触连接 

了解后岛叶皮层功能后，作者就其下游脑区展开研究。他们在小鼠后岛叶皮层注射AAV-hSyn-Chronos-eGFP，发现杏仁核各亚区中均存在eGFP阳性神经纤维（图2A-B）。为证实上述神经纤维在杏仁核中产生功能性突触而非过路，作者使用膜片钳电生理方法记录外侧杏仁核（LA）以及中央杏仁核（CeA）神经元，发现光激活后岛叶皮层神经元在杏仁核的纤维可引起LA、CeA神经元产生兴奋性突触后电流（图2C-D）。

接下来，作者使用逆行示踪方法，分别在小鼠LA或CeA中注射不同颜色霍乱毒素B（CTB），发现LA与CeA在后岛叶皮层中的上游神经元分属不同亚群，几乎无共标（图2E-G）。 

图2 后岛叶皮层与LA、CeA形成兴奋性突触连接

3.岛叶-杏仁核不同环路参与恐惧学习与恐惧记忆

上文已知，后岛叶皮层到杏仁核有两条不同环路，那么其功能是否也不同呢？作者就此展开以下研究。他们在小鼠后岛叶皮层中注射AAV-hSyn-eNpHR3.0，在CeA或LA埋植光纤，在US过程中给予黄光抑制不同环路。他们发现光抑制后岛叶-CeA环路后，与对照组相比，实验组小鼠训练过程中颤栗行为显著减少，而后一天颤栗行为无差异；光抑制后岛叶-LA环路后，小鼠训练过程中颤栗行为无差异，而后一天颤栗行为显著减少（图3）。

综上，后岛叶-CeA环路参与恐惧学习，后岛叶-LA环路参与恐惧记忆。 

图3 岛叶-杏仁核不同环路参与恐惧学习或恐惧记忆

4.岛叶-杏仁核不同环路编码恐惧学习与恐惧记忆

探究岛叶-杏仁核不同环路在不同功能中的必要性后，作者探究其充分性。他们在小鼠CeA或LA中注射逆行表达病毒AAVretro-hSyn-Chronos-eGFP[12]，在后岛叶皮层中植入光纤，以光激活环路替代足底电击作为US，发现光激活后岛叶-CeA环路引起小鼠颤栗行为，后一天CS引起探索行为；光激活后岛叶-LA环路引起摇头晃脑、向后行走等厌恶性行为，后一天CS引起逃避行为（图4）。

以上结果表明光激活后岛叶-CeA环路编码恐惧学习过程，而光激活后岛叶-LA环路编码厌恶性情绪，从而驱动恐惧记忆的重提取。

图4 岛叶-杏仁核不同环路编码恐惧学习或恐惧记忆

5.岛叶神经元活性反映听觉CS的恐惧学习过程

接下来，作者引入在体电生理方法进一步探究后岛叶皮层在恐惧学习过程中的功能。他们在ChR2报告鼠的LA中注射逆行表达病毒AAVretro-EF1α-mCherry-ires-Cre并在后岛叶皮层植入光电极（图5A-B）。然后引入条件恐惧范式（图5C），发现开始时投射到LA的后岛叶神经元对听觉CS无反应，随着小鼠的训练，此类神经元发放逐渐增强且可持续到第二天（图5D-F）。此外，这群神经元在训练期与训练后一天中对CS与US的反应水平均显著增强（图5G-I）。 

图5 岛叶神经元活性反映听觉CS的恐惧学习过程

6.后岛叶皮层参与恐惧记忆重提取过程 

图5结果表明在恐惧学习过程中，小鼠后岛叶皮层中存在联合性神经可塑性。由于记忆功能与可塑性相关，后岛叶皮层很可能参与恐惧记忆重提取过程。为证实上述假设，作者再次使用光遗传方法，在训练后一天双侧光抑制小鼠后岛叶皮层，发现小鼠颤栗行为显著减少（图6），表明后岛叶皮层神经元活性在恐惧记忆的重提取过程中具有必要性。

图6 后岛叶皮层参与恐惧记忆重提取过程

总结

恐惧学习与恐惧记忆对于人类及动物在自然界中的生存具有必要性。在恐惧学习过程中，我们的大脑将无害的感觉刺激与厌恶性刺激偶联，产生可塑性变化，由此形成恐惧记忆。过去研究表明，恐惧记忆的核心脑区为杏仁核，但对于杏仁核接受哪些脑区投射以介导厌恶性信息的传递，我们知之甚少。本篇文章结合光遗传学、在体电生理、神经元示踪、行为学等方法，首次发现后岛叶皮层为恐惧学习中传递厌恶性信息的杏仁核上游脑区，其中后岛叶-CeA环路调控恐惧学习，后岛叶-LA环路调控恐惧记忆。此外，后岛叶神经元活性与小鼠的恐惧水平密切相关，抑制这些神经元可阻断恐惧记忆的重提取（图7）。这项研究阐释了编码恐惧学习与恐惧记忆过程的环路机制，为临床解决恐惧症等相关疾病提供有力帮助！

图7 调控恐惧学习与恐惧记忆过程的神经环路机制

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参考文献

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2.Fanselow, M.S., Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychon Bull Rev, 1994. 1(4): p. 429-38.

3.Davis, M., The role of the amygdala in fear and anxiety. Annu Rev Neurosci, 1992. 15: p. 353-75.

4.Kim, W.B. and J.H. Cho, Encoding of Discriminative Fear Memory by Input-Specific LTP in the Amygdala. Neuron, 2017. 95(5): p. 1129-1146 e5.

5.Cechetto, D.F. and C.B. Saper, Evidence for a viscerotopic sensory representation in the cortex and thalamus in the rat. J Comp Neurol, 1987. 262(1): p. 27-45.

6.Peng, Y., et al., Sweet and bitter taste in the brain of awake behaving animals. Nature, 2015. 527(7579): p. 512-5.

7.Rodgers, K.M., et al., Auditory, somatosensory, and multisensory insular cortex in the rat. Cereb Cortex, 2008. 18(12): p. 2941-51.

8.Sawatari, H., et al., Identification and characterization of an insular auditory field in mice. Eur J Neurosci, 2011. 34(12): p. 1944-52.

9.Peltz, E., et al., Functional connectivity of the human insular cortex during noxious and innocuous thermal stimulation. Neuroimage, 2011. 54(2): p. 1324-35.

10.Berthier, M., S. Starkstein, and R. Leiguarda, Asymbolia for pain: a sensory-limbic disconnection syndrome. Ann Neurol, 1988. 24(1): p. 41-9.

11.Berret, E., et al., Insular cortex processes aversive somatosensory information and is crucial for threat learning. Science, 2019. 364(6443).

12.Tervo, D.G., et al., A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron, 2016. 92(2): p. 372-382.