自闭症主要表现为社会人际交往和语言交流障碍和行为刻板。我国0-6岁的儿童诊断为自闭症的人数占总人口数近8%，根据局部抽样调查数据推算，中国患儿人数已经超过百万，受自闭症困扰的人群高达千万。自闭症的发病机制尽管尚不明确，但很大程度上是由于基因突变而引起，如基因MeCP2、SHANK3、NLGN3敲除动物的呈现了自闭症样行为,特别是MeCP2转基因猴[1]和SHANK3 [2] 敲除猴也呈现了自闭症样的行为，揭示了自闭症的遗传性病因。
2019年8月6日，《Molecular Psychiatry》杂志在线发表了暨南大学师蕾教授团队与中山大学蒋斌教授团队以及暨南大学叶文才教授共同合作题为“Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function”的研究论文[3]。该研究揭示了Dock4-Rac1调控海马中谷氨酸受体的蛋白合成对兴奋性突触传递和社交行为进行调节的新机制，同时作者发现Dock4是自闭症形成的易感基因，对自闭症的发病机制以及治疗靶点的研究提供新的思路。
Rac1是肌动蛋白的主要调控因子，在调节神经递质受体的定位和兴奋性突触的结构方面发挥着重要作用，Rac1的活性受到Rac1鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTPase活化蛋白(GAPs)的严格控制，这两个蛋白家族分别直接激活和抑制Rac1蛋白。Dock4，胞质分裂作用因子4，GEFs的DOCK家族成员。
首先，作者借助Cre-LoxP原理构建Dock4敲除鼠（KO鼠，图1a），并运用分子生物学手段检测发现，KO小鼠脑内Dock4 mRNA水平和蛋白表达均完全缺失，尼氏染色结果显示，与WT小鼠相比，KO小鼠的侧脑室略显增大（图1b,c）。此外，雌性KO小鼠的脑结构略重于雌性WT小鼠，有意思的是，一小部分雌性KO小鼠表现出自闭症类似行为---过度活跃和刻板行为，而雄性KO小鼠则无此现象（图1e,f）。这一小部分小鼠被排除在后续研究中。为研究Dock4 KO小鼠的语言交流能力，他们评估了幼鼠的超声波发声，发现Dock4 KO幼仔在出生后第3、6、9和12天发出的叫声次数比同窝出生WT仔畜的更多，持续的时间也更长（图1g），提示了Dock4 KO小鼠存在沟通异常现象[4]。随后，作者进一步评估了KO小鼠的社交行为。母性行为测试发现，雌性KO小鼠衔回幼崽所花费的时间更长（图1h），三室社交行为学结果发现，在社交新奇阶段，KO小鼠无法区分熟悉小鼠与陌生小鼠（图1i-m）。这些结果显示，Dock4 KO小鼠表现为语言和社交障碍，以及刻板行为的增加趋势。
图1 Dock4 KO小鼠表现出社交缺陷
除上述核心症状外，ASD患者通常还会同时出现焦虑和智力障碍等症状[5,6]，因此，作者通过行为学范式检测KO小鼠的焦虑行为和认知能力。高架零形迷宫（EZM）行为学实验结果显示，Dock4 KO小鼠的总距离明显缩短，此外，雄性KO小鼠的焦虑水平高于雌性KO小鼠，表现为雄性 KO小鼠在零形迷宫的开放区域停留时间减少，且其进入开放区域的次数也显著降低（图2a-c）。进一步，为评估KO小鼠的认知能力，科研人员通过一系列行为学范式对小鼠进行多项学习、记忆测试。在新颖物体识别测试中，雌性KO小鼠无法区分新的物体和熟悉的物体（图2d），Y形迷宫行为学结果发现，雄性KO小鼠出现工作记忆受损以及空间识别记忆障碍的现象（图2e-h）。综上，这些结果表明，缺失Dock4基因的小鼠呈现了自闭症类似的行为，表现为社交障碍，焦虑及学习记忆缺陷。
图2 Dock4 KO小鼠表现为高度焦虑行为以及学习记忆受损
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海马区Dock4基因敲除小鼠的兴奋性传递出现异常及突触受体数量减少
海马在社交和识别记忆方面发挥着核心作用[7]，同时也是Dock4表达高度富集区域（图1c）。因此，为研究海马区Dock4的作用，他们借助AAV病毒载体（AAV-CAG-mCherry-T2A-Cre）特异性敲除海马区Dock4（图3a），结果发现，这些海马区条件性敲除小鼠同样也无法区分熟悉小鼠与陌生小鼠，表征了KO小鼠的社交缺陷（图1i-m,图3b-d），这提示了社交新奇偏好依赖于海马区Dock4的调节。此外，电生理手段发现，KO小鼠海马CA1区锥体神经元微小型兴奋性突触后电流(mEPSCs)的振幅小于WT小鼠的，而微小型抑制性突触后电流(mIPSCs)无明显变化（图3e-j）。
随后，他们记录了来自同一锥体细胞诱发的EPSC和IPSC，来进一步验证兴奋/抑制(E/I)平衡是否受到Dock4缺失的影响。发现，KO小鼠锥体细胞中EPSC的振幅显著降低， IPSC无明显变化，因此，KO细胞的E/I比值明显小于WT细胞（图3k-n），提示了KO小鼠海马CA1区锥体神经元的E/I平衡向抑制方向转移。进一步，为研究KO小鼠神经元EPSC减少是否是由于突触前功能受损所致，作者比较了EPSC幅值中双脉冲比(PPRs)，结果发现在WT和KO小鼠神经元中均观察到双脉冲促进作用(图3o, p)，提示了Dock4 KO小鼠海马兴奋性突触传递减弱可能与突触后功能障碍有关。
图3 海马区Dock4的缺失导致社交障碍和兴奋性突触传递受损
基于上述结果，科研人员分析了AMPAR和NMDA介导的EPSCs的输入-输出特性，有趣的是，经过一系列强度刺激后，KO细胞中这两种受体介导的EPSCs均显著降低，NMDAR-EPSCs更为显著，即Dock4缺失导致NMDAR-EPSCs 与AMPAR-EPSCs的比值降低（图4a-c）。此外，他们还发现ifenprodil（GluN2B拮抗剂）对KO小鼠神经元NMDAR - EPSCs的阻断作用明显弱于WT小鼠神经元，表明KO小鼠神经元内含有较少的GluN2B突触受体（图4d）。同时，作者借助全细胞记录对Schaffer侧枝-CA1区突触可塑性进行研究，发现，KO小鼠神经元长时程增强作用（LTP）显著降低（与WT小鼠比较），而APV（NMDAR拮抗剂）则可以阻断WT或KO小鼠神经元海马Schaffer侧枝-CA1区LTP的诱导（图4e）。接下来，作者继续研究兴奋性突触传递障碍是否与突触数量和AMPARs及NMDARs表达的改变有关。Golgi染色发现，KO小鼠海马CA1和DG区神经元树突棘明显减少（图4f,g），AMPAR和NMDAR亚基 (包括GluA2、GluN1、GluN2A和GluN2B)的突触表达显著降低（图4h,i），提示了AMPAR和NMDAP介导的EPSCs减弱可能与相应突触受体数量减少有关。
图4 Dock4 KO小鼠海马区AMPA和NMDA受体功能受损
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Dock4-Rac1调控海马中谷氨酸受体的蛋白合成
上述谷氨酸受体表达的减少可能是由于蛋白质过度降解或mRNA翻译减弱所致。为了验证这些可能的原因，他们借助RNAi技术，在培养的原代海马神经元中敲低Dock4基因，同样观察到GluA2、GluN1、GluN2A和GluN2B的蛋白表达降低，与上述结果一致（图4h,i, 图5a,b）。而用MG132（蛋白酶体抑制剂）处理后，也未能恢复受体的表达（图5a,b），这提示了蛋白表达水平的降低可能是由于蛋白合成/mRNA翻译的缺失引起的。此外，puromycin标记（氨酰tRNA类似物，标记新合成多肽）发现Dock4 KO小鼠海马神经元中整体蛋白合成明显低于WT小鼠（图5c,d）。随后，他们借助WB分析Dock4是否通过诱导Rac1激活影响蛋白质合成，发现过表达Dock4可诱导蛋白合成，而Rac1抑制剂则可逆转这一现象，同时，缺失了整个Dock4截短突变体的Rac1激活域（945VS）的不能促进蛋白合成，而过表达WT-Rac1或组成型激活突变（CA）则可以诱导蛋白合成（图5e-j）。此外，GTP-Rac1在KO小鼠海马区明显减少，表明当Dock4缺失时，Rac1的激活会减弱（图5k,l）。接下来，作者借助慢病毒介导的WT-Rac1转染Dock4缺失神经元，观察发现，Rac1过表达促使Dock4缺失神经元的整体蛋白合成能力恢复到正常水平，并有效逆转了Dock4敲低导致的GluA2、GluN1、GluN2A和GluN2B的表达降低现象（图5m-p）。总之，这些结果提示了Dock4对AMPARs和NMDARs正常表达至关重要，可能是通过Rac1调控蛋白合成来发挥作用。
图5 Dock4-Rac1调控海马中谷氨酸受体的蛋白合成
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提高Rac1活性或NMDAR功能可恢复Dock4 KO小鼠的社交行为障碍
最后，作者进一步验证Rac1过表达是否能恢复Dock4 KO小鼠的行为缺陷。他们将Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1双侧注射Dock4 KO小鼠海马CA1区（图6a-c）。病毒表达四周后观察发现，Dock4敲除的小鼠的突触信号传递和异常的社交行为均得到了显著的改善（图6d-j）。此外，Dock4 KO小鼠体内注射D-环丝氨酸（DCS，一种NMDA受体的激动剂）也出现类似现象（图k-m）。
图6 提高Rac1活性或NMDAR功能可恢复Dock4 KO小鼠的社交行为障碍
结论
本篇文章借助敲除鼠、病毒载体介导的过表达和感染、分子生物学以及电生理等技术手段研究发现，缺失Dock4基因的小鼠呈现了自闭症类似的行为，表现为社交障碍、焦虑及学习记忆缺陷。Dock4基因敲除小鼠的海马兴奋性传递出现异常及突触受体数量减少。机理上分析缺失Dock4蛋白后，海马CA1神经元中的Rac1蛋白（Dock4的下游分子）调控的谷氨酸受体的蛋白合成下降，导致兴奋性突触传递功能降低和海马神经元突触棘减少。在正常小鼠海马CA1神经细胞中，条件敲除Dock4后，小鼠再现了社会偏好缺陷。而在Dock4敲除的小鼠的海马CA1神经细胞中病毒转染过表达Rac1蛋白或体内注射D-环丝氨酸（DCS，一种NMDA受体的激动剂）都可以显著改善小鼠的异常的社交行为和恢复突触的信号传递。
该研究受国家自然科学基金委员会与英国皇家学会/英国医学科学院人才项目，广东省“珠江人才计划”本土创新科研团队项目，国家重点研发计划，国家自然科学资金，广东省重点项目的支持。
文中借助病毒载体实现的过表达和条件性敲除已广泛用于体内的基因操作，和元上海有幸提供实验中使用的AAV病毒（AAV-CAG-mCherry-T2A-Cre，pAAV-CAG-MCSmCherry-3FLAG，Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1，Lenti-CMV-EGFP-P2A-MCS-3FLAG），用实际行动助力中国脑科学的发展。
参考文献：
1, Liu Z et al., (2015) Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeys overexpressing MeCP2. Nature 530(7588):98-102.
2, zhou y et al., (2019) Atypical behaviour and connectivity in SHANK3-mutantmacaques. Nature 570(7761):326-331.
3, Jiang B, Shi L et al.Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. Mol Psychiatry. 2019. doi: 10.1038/s41380-019-0472-7.
4, Nakatani J et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell.2009;137:1235–46.
5, Simonoff E et al. Psychiatric disorders in children with autism spectrum disorders: prevalence, comorbidity, and associated factors in a population-derived sample. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry. 2008;47:921–9.
6, Eussen ML et al. The association of quality of social relations, symptom severity and intelligence with anxiety in children with autism spectrum disorders. Autism. 2013;17:723–35.
7, Okuyama T. Social memory engram in the hippocampus. Neurosci Res. 2018;129:17–23.
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