此曲以多种景物并置，组合成一幅秋郊夕照图，十分具有意境。小桥流水人家等外界环境提供了戏曲家感觉信息，使他产生“断肠”的情感，那么这种情感如何产生呢？研究表明，外界环境带来的感觉信息由大脑皮层神经环路整合与编码。感觉刺激会引起皮层神经环路的突触可塑性产生变化，进而长期改变神经环路的活动水平[1]。在神经元中，多种转录因子转录水平的变化在上述过程中发挥重要作用[2]，但这些转录因子的活性如何受神经活性的影响，尚未可知。
为深入了解机体接受外环境信息的过程中转录水平如何影响突触可塑性，我们需要在体同时记录大量神经元的活动水平与转录水平。近期研究通过基因编码钙指示剂（GECI）可以实现神经元活性的在体成像[3]，然而对于转录因子的活性，目前研究依然处于离体检测水平[4]。
在神经元中，与神经活性密切相关的转录因子之一便是环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）。CREB介导突触可塑性，参与学习、记忆等功能[6]。因此，如果能够实现单细胞水平的CREB在体成像，我们便可深入解析环境信息如何对神经元转录动力学产生影响。
2019年12月26日，《Neuron》杂志在线刊登了马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所Ryohei Yasuda研究组的最新重要工作[7]，他们开发了两种基于荧光共振能量转移（FRET）的CREB指示剂。通过这种指示剂，他们可实现神经元活动水平和转录水平的同时成像。他们发现，皮层神经元活动水平和转录水平之间的关系受机体的感觉经历调控。该研究拓宽了神经元成像领域的应用广度，极大促进了神经科学领域的研究进展。
图片来源：National Institutes of Health
研究表明，CREB信号的主要磷酸化位点为S133[8]。因此，作者开发了两种通过KIX肽监测S133磷酸化水平的生物指示剂，以检测胞内CREB的激活水平。其中，G-CREB表达绿色荧光蛋白，R-CREB表达红色荧光蛋白（图1A）。为测量FRET的变化水平，作者引入双光子荧光寿命成像（2pFLIM）系统[9]。他们在HEK细胞中表达G-CREB或R-CREB，通过毛喉素诱导cAMP表达水平上调以激活CREB。他们发现两种CREB指示剂与CREB的结合率均显著增加，而将S133突变为丙氨酸（S133A）之后，CREB指示剂的结合率不再增加（图1B-F）。此外，加入腺苷酸环化酶抑制剂NKY80之后，CREB指示剂的结合率下降（图1G）。接着，他们在海马神经元中进一步检验CREB指示剂的功能。他们在海马神经元中表达GCaMP6s和R-CREB，发现加入NMDA之后CREB指示剂的结合率显著增加（图1H-I）。他们还发现，电刺激Schaffer侧枝轴突时，神经元钙信号与CREB信号均显著增加，CREB信号持续时间更长（图1J-M）。综上，作者开发的CREB指示剂可以胜任神经元CREB活性的检测，此指示剂具有特异性与可逆性。
2.感觉皮层2/3层神经元中CREB活性的在体检测
接下来，作者检验CREB指示剂的在体功能。他们在小鼠感觉皮层2/3层中注射AAV-pSyn-G-CREB，使用膜片钳电生理记录G-CREB阳性神经元（图2A）。他们发现这些神经元的发放水平无显著性变化（图2B-C），表明G-CREB并不会影响神经元的本底活性。然后，他们使用2pFLIM系统检测感觉皮层2/3层神经元中G-CREB与CREB的结合率。他们发现G-CREB的结合率显著高于S133A突变体，结合CREB的稳定性也更高（图2D-I）。加入毛喉素后，G-CREB的结合率显著增加，而S133A突变体的结合率无显著变化（图2J-L）。以上结果表明，在体条件下CREB指示剂可以检测皮层神经元的CREB活性，且指示剂具有特异性。
图2 感觉皮层2/3层神经元中CREB活性的在体检测3.环境丰富化对感觉皮层神经元CREB动力学的影响
研究表明，环境丰富化可以改变感觉皮层区域的神经可塑性[10]，CREB等多种信号分子参与其中[11]。为在体探究环境丰富化过程中小鼠感觉皮层相同神经元CREB信号的动态变化，作者引入2pFLIM系统与环境丰富化（EE）范式。他们发现在环境丰富化条件下，小鼠感觉皮层的CREB信号显著增强（图3），表明在体2pFLIM技术可实现不同环境中CREB活性的单细胞检测。
图3 环境丰富化对感觉皮层神经元CREB动力学的影响在前文中我们提到，若要深入探究神经元活动水平与转录水平之间的关系，我们需实现神经元钙信号与CREB信号的同时在体记录。于是，作者在小鼠运动皮层或视皮层2/3层中混合注射AAV-pSyn-R-CREB和AAV-pSyn-GCaMP6s，使用2pFLIM系统记录两种指示剂的信号（图4A-D）。他们发现，在小鼠运动皮层与视皮层中，两种信号之间均无任何干扰性作用（图4D-G），表明R-CREB和GCaMP6可同时在体成像。
在验证CREB和GCaMP可同时成像之后，作者进一步探究初级视皮层（V1）中两种信号是否偶联，以及此偶联效应是否依赖于感觉经历。过去研究发现，成年小鼠的黑暗饲养（DR）会改变V1中依赖于NMDA受体的神经可塑性[12]。由此，作者推测DR可改变V1中钙信号与CREB信号之间的关系。他们在小鼠的V1中混合注射AAV-pSyn-R-CREB和AAV-pSyn-GCaMP6s，黑暗饲养后给予视觉刺激30分钟（图5A）。他们发现，DR小鼠在面对视觉刺激的过程中，其CREB信号显著增强，增强的信号可维持24小时之久；而对于未接受视觉刺激的DR小鼠，其CREB信号不变；对于未进行DR处理的小鼠，其CREB信号先增强后减弱，24小时后恢复至本底水平（图5B-D）。这表明，V1神经元CREB活动对视觉刺激的反应强度与反应时间均与机体的感觉经历密切相关。 除CREB活性之外，视觉刺激也会引起V1神经元钙信号显著增强（图6A-B）。作者发现，在相同钙活性的V1神经元中，DR小鼠的CREB活性更高（图6C）。他们还发现，对于CREB活性显著升高的神经元，不管来源于DR小鼠还是对照组小鼠，其CREB活性与钙活性的关系曲线十分接近。不过，其中来源于DR小鼠的神经元，其CREB活性可维持24小时以上，而来自于对照小鼠的神经元无法维持（图6D）。此外，在DR小鼠与对照小鼠V1神经元中，30分钟刺激后的CREB活性变化与24小时后的CREB活性变化呈正相关（图6E）。综上所述，V1神经元CREB活动与钙活动密切相关，且二者之间的偶联关系受机体的感觉经历调控。 图6 V1神经元钙活动与CREB活动之间的关系
总结
外界环境带来的感觉信息会影响大脑皮层的神经可塑性，探究其中的机理有助于我们深入理解学习与记忆的神经机制。为实现此目的，我们需要在体同时记录神经元的活动水平与转录水平。通过GECI，我们可实现神经元钙活动的在体成像。但对转录水平的活性检测，目前的技术只能望洋兴叹。本篇文章开发了两种新型CREB指示剂——G-CREB与R-CREB，这两种指示剂可特异性检测神经元内CREB的活动水平，进而探究神经可塑性的变化。通过CREB信号与钙信号的同时成像，作者发现V1神经元CREB活动与钙活动密切相关，且二者之间的偶联关系受机体的感觉经历调控。这项研究提供了新型技术手段，为神经领域的研究提供了新策略，也让我们更加理解“枯藤老树昏鸦”带给我们的意境感！
1.Holtmaat, A. and P. Caroni, Functional and structural underpinnings of neuronal assembly formation in learning. Nat Neurosci, 2016. 19(12): p. 1553-1562.2.Yap, E.L. and M.E. Greenberg, Activity-Regulated Transcription: Bridging the Gap between Neural Activity and Behavior. Neuron, 2018. 100(2): p. 330-348.3.Cichon, J. and W.B. Gan, Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature, 2015. 520(7546): p. 180-5.4.Alberini, C.M., Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity. Physiol Rev, 2009. 89(1): p. 121-45.5.Yang, S.J., et al., Extended field-of-view and increased-signal 3D holographic illumination with time-division multiplexing. Opt Express, 2015. 23(25): p. 32573-81.6.Han, J.H., et al., Neuronal competition and selection during memory formation. Science, 2007. 316(5823): p. 457-60.7.Laviv, T., et al., In Vivo Imaging of the Coupling between Neuronal and CREB Activity in the Mouse Brain. Neuron, 2019.8.Parker, D., et al., Phosphorylation of CREB at Ser-133 induces complex formation with CREB-binding protein via a direct mechanism. Mol Cell Biol, 1996. 16(2): p. 694-703.9.Yasuda, R., et al., Supersensitive Ras activation in dendrites and spines revealed by two-photon fluorescence lifetime imaging. Nat Neurosci, 2006. 9(2): p. 283-91.10.Bengoetxea, H., et al., Enriched and deprived sensory experience induces structural changes and rewires connectivity during the postnatal development of the brain. Neural Plast, 2012. 2012: p. 305693.11.van Praag, H., G. Kempermann, and F.H. Gage, Neural consequences of environmental enrichment. Nat Rev Neurosci, 2000. 1(3): p. 191-8.12.Philpot, B.D., J.S. Espinosa, and M.F. Bear, Evidence for altered NMDA receptor function as a basis for metaplasticity in visual cortex. J Neurosci, 2003. 23(13): p. 5583-8.
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