【Nat Commun.】见微知著！浙江大学陈忠团队揭示黑质-丘脑通路促进颞叶癫痫的环路机制
其中，颞叶癫痫的治疗尤其具有挑战性。其一，机体对抗癫痫药物的耐药性很高[1]。其二，外科切除颞叶中的癫痫灶可能仍然无法缓解癫痫症状[2]。因此，若要解决颞叶癫痫这一大难题，我们需解析大脑中参与并调控颞叶癫痫的神经网络。正所谓孙子兵法有云:“知己知彼,百战不殆。”
颞叶 图片来源： neurologyadvisor.com
临床研究表明，颞叶癫痫患者的黑质（SN）体积相对较小，其中铁离子含量也相对偏低[3, 4]。神经生物学研究表明，在癫痫模型大鼠中，黑质网状部（SNr）的结构与功能均发生改变[5-7]。此外，靶向SNr的损毁、药物干扰或深部脑刺激均会调控癫痫发作的强度[8-10]。然而，对于SNr中参与颞叶癫痫的细胞类型及其环路机制，尚未可知。
2020年2月17日，《Nature Communications》杂志在线刊登了浙江大学陈忠教授的最新重要工作[11]，他们发现黑质网状部小清蛋白阳性（PV）神经元与丘脑束旁核神经元参与并调控颞叶癫痫。本篇文章首次揭示黑质网状部调控颞叶癫痫的神经元亚群及其环路机制，极大提高了人们在癫痫领域的认知。
结果
1. SNr PV神经元参与颞叶癫痫
首先，为探究SNr PV神经元是否参与颞叶癫痫过程，作者引入钙信号光纤记录方法。他们在PV-Cre小鼠的SNr中注射AAV-DIO-GCaMP6m，并植入光纤（图1a）。他们发现，在单侧海马点燃诱导的局灶性癫痫与全面性癫痫模型小鼠中，同侧SNr PV神经元的活性显著增加（图1b），表明SNr PV神经元参与颞叶癫痫过程。
图1 SNr PV神经元在颞叶癫痫过程中被激活
2. 光激活SNr PV神经元促进颞叶癫痫
接着，为探究SNr PV神经元在颞叶癫痫过程中的功能，作者引入光遗传学神经元操控方法。他们在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ChR2-mCherry，植入光电极以验证ChR2阳性神经元可被蓝光而非黄光激活（图2c-e）。他们发现，光激活SNr PV神经元加速了颞叶癫痫发作阶段，延长了后放电持续时间，易化了颞叶癫痫的诱导过程（图2f-h）。此外，光激活此类神经元增加了颞叶癫痫过程中小鼠的脑电指数（图2i-j）。以上结果表明，SNr PV神经元在海马点燃诱导的颞叶癫痫过程中起促进作用。
图2 光激活SNr PV神经元促进海马点燃诱导的颞叶癫痫过程
3. 光抑制SNr PV神经元延缓颞叶癫痫
然后，作者进一步探究生理状态下SNr PV神经元在海马点燃诱导的颞叶癫痫过程中是否具有必要性。他们再次引入光遗传学，他们在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ArchT，植入光电级以验证ArchT阳性神经元可被黄光而非蓝光抑制（图3a-c）。他们发现，光抑制SNr PV神经元延缓了颞叶癫痫发作阶段，缩短了后放电持续时间，弱化了颞叶癫痫的诱导过程，而不改变后放电阈（图3d-g）。此外，光抑制此类神经元降低了颞叶癫痫过程中小鼠的脑电指数（图3h-i）。
图3 光抑制SNr PV神经元延缓海马点燃诱导的颞叶癫痫过程
接着，作者探究生理状态下SNr PV神经元在其它颞叶癫痫模型中是否同样具有必要性。他们在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-hM4Di，通过CNO抑制hM4Di阳性神经元，并在小鼠海马注射红藻氨酸（KA）以诱导颞叶癫痫（图4a）。他们发现抑制SNr PV神经元后，小鼠产生全面性癫痫与癫痫持续状态的潜时显著增加，产生全面性癫痫与局灶性癫痫的次数显著减少，脑电频率上升的持续时间亦显著减少（图4b-f）。此外，抑制SNr PV神经元后，KA诱导的慢性自发性癫痫亦显著减少，表现在全面性癫痫与局灶性癫痫的次数和时间显著减少（图4g-l）。
他们还在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-hM3Dq，通过CNO激活hM3Dq阳性神经元（图4m）。他们发现，全面性癫痫与局灶性癫痫的次数和时间显著增加，2只小鼠甚至死亡（图4n-o）。
综上所述，SNr PV神经元可双向调控颞叶癫痫，其中激活此类神经元促进颞叶癫痫，抑制此类神经元延缓颞叶癫痫。
图4 SNr PV神经元双向调控KA诱导的颞叶癫痫
4. SNr-PF PV 投射双向调控颞叶癫痫
接下来，作者探究SNr PV神经元通过哪个下游脑区调控颞叶癫痫。过去研究表明，丘脑是SNr PV神经元的重要下游[12]，于是作者就SNr PV到丘脑多种核团的投射展开以下研究。
他们在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ArchT，在丘脑束旁核（PF）、腹内侧核（VM）、网状核（RT）或连结核（RE）植入光纤（图5a-b）。他们发现，光抑制SNr PV神经元投射到PF的神经纤维末稍（SNr-PF PV 投射）延缓了海马点燃诱导的颞叶癫痫发作阶段，缩短了后放电持续时间，弱化了颞叶癫痫的诱导过程（图5c-e）,而光抑制其它三种投射则无此现象。他们又在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ChR2，在PF植入光纤，发现光激活SNr-PF PV 投射促进了海马点燃诱导的颞叶癫痫发作过程，而在PF注射GABAA受体拮抗剂可阻断这一过程（图5f-i）。
以上结果表明，SNr PV神经元通过PF调控海马点燃诱导的颞叶癫痫。
图5 SNr-PF PV投射调控海马点燃诱导的颞叶癫痫
5. SNr PV神经元与PF GABA能神经元之间形成抑制性突触联系
为进一步探究SNr PV神经元到PV神经元的功能性投射，他们在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ChR2，使用膜片钳电生理方法记录PF神经元，通过发放的动力学判断记录神经元的细胞类型（图6a）。他们发现在光激活SNr PV神经元投射至PF纤维末梢的条件下，50% PF GABA能神经元的发放频率降低，19.2% PF谷氨酸能神经元的发放频率降低，而23.1% PF谷氨酸能神经元的发放频率升高（图6b）。
为证实SNr到PF GABA能神经元产生抑制性直接投射，作者在Vgat-Cre小鼠的SNr中注射AAV-DIO-ChR2（这里，通过GABA能神经元表征PV神经元。因为在SNr中，PV神经元占GABA能神经元很大一部分），在PF中注射AAV-DIO-eYFP，并记录PF中eYFP阳性神经元（图6c-d）。他们加入河豚毒素和4-氨基吡啶（TTX+4-AP）抑制神经元发放以阻断间接投射，发现在一些PF GABA能神经元中可记录到突触后电流，此突触后电流可被GABAA受体拮抗剂阻断（图6e），表明SNr到PF GABA能神经元产生GABA介导的抑制性直接投射。
为进一步证实上述结论，作者使用基于狂犬病毒（RV）的逆行示踪手段，他们在Vgat-Cre小鼠的PF中注射RV和辅助AAV，发现SNr中存在大量PF GABA能神经元的上游神经元，其中62.83 ± 3.23% 上游神经元为PV阳性，~30% SNr PV神经元为PF GABA能神经元的上游神经元（图6f-i）。
综上，SNr PV神经元直接投射到PF GABA能神经元，此抑制性投射由GABA所介导。
6. PF GABA能神经元双向调控颞叶癫痫
上文已知，SNr-PF PV 投射双向调控颞叶癫痫，SNr-PF PV 投射主要下游为PF GABA神经元，那么PF GABA能神经元是否同样具有颞叶癫痫的调控功能呢？作者就此展开研究。
他们在Vgat-Cre的PF中注射AAV-DIO-ArchT并植入光纤，发现光抑制PF GABA能神经元促进了海马点燃诱导的颞叶癫痫发作阶段，延长了了后放电持续时间，强化了颞叶癫痫的诱导过程（图7a-f）。他们还通过ChR2或hM3Dq激活PF GABA能神经元，发现激活这些神经元会抑制海马点燃诱导的颞叶癫痫，具体的结果与上文一致（图7g-q）。
以上结果表面，PF GABA能神经元双向调控颞叶癫痫，其中激活此类神经元抑制颞叶癫痫，抑制此类神经元促进颞叶癫痫，与SNr PV神经元的调控作用相反。
7. PF谷氨酸能神经元双向调控颞叶癫痫
最后，作者探究PF谷氨酸能神经元的功能。他们使用在体电生理手段记录麻醉小鼠PF的GABA能神经元和谷氨酸能神经元，通过单侧海马点燃诱导颞叶癫痫。他们发现在同侧PF中，54.5% GABA能神经元被抑制，极少数被激活；50%谷氨酸能神经元被激活，极少数被抑制（图8a-c）。此外，光激活PF GABA能神经元会抑制PF谷氨酸能神经元（图8d），表面SNr PV神经元可能通过PF GABA能神经元去抑制PF谷氨酸能神经元。
他们还发现，光抑制PF谷氨酸能神经元延缓海马点燃诱导的颞叶癫痫过程（图8e-h）；而光激活PF谷氨酸能神经元促进海马点燃诱导的颞叶癫痫过程（图8i-l），表明PF谷氨酸能神经元亦双向调控颞叶癫痫，其中激活此类神经元促进颞叶癫痫，抑制此类神经元延缓颞叶癫痫。
图8 PF谷氨酸能神经元双向调控颞叶癫痫
总结
癫痫是一种慢性神经系统疾病，在神经科其患者数量仅次于头痛病，其中颞叶癫痫尤为难治。因此，解析调控颞叶癫痫的脑神经环路对临床治疗颞叶癫痫十分重要。过去研究显示，SNr很可能参与颞叶癫痫的调控过程，然而对于其中参与颞叶癫痫的细胞类型、下游脑区及其环路机制，我们知之甚少。本文结合疾病模型构建、光遗传学、化学遗传学、电生理等方法，发现SNr PV神经元、PF GABA能神经元、PF谷氨酸能神经元均参与颞叶癫痫的调控过程，其中SNr神经元与PF GABA能神经元之间形成抑制性突触联系。此抑制性投射去抑制PF谷氨酸能神经元，进而调控颞叶癫痫（图9）。这项研究阐释了调控颞叶癫痫的脑区及其神经环路机制，为治疗颞叶癫痫提供了新型药物靶点！
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