【Cell】神之庇佑！硒抑制神经元铁死亡治疗出血性脑卒中的分子机制
脑出血（ICH），又称脑溢血，是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，占全部脑卒中的20%～30%，急性期病死率为30%～40%。发生的原因主要与脑血管的病变有关，与高血脂、糖尿病、高血压、血管的老化、吸烟等密切相关。脑出血的发病率与致死率均非常高，但依然未有成熟的疗法[1]。
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目前，脑出血的治疗方法主要针对脑出血后的继发性脑损伤[2]。继发性脑损伤发生于脑出血后的一段时间，由裂解血中多种因子引起，其中包含血红素以及氧化型亚铁血红素等等[3]。
继发性脑损伤（图片来源： neurologyadvisor.com）
近期研究表明，脑出血造成的继发性脑损伤由铁死亡引起。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式[4]。除脑出血之外，铁死亡还参与肿瘤细胞氧化应激、植物热应激、缺血再灌注损伤、创伤性脑损伤以及帕金森疾病。但是，铁死亡刺激引起细胞产生适应性转录的分子机制，及抑制铁死亡的方法，尚未可知。
2019年5月2日，《Cell》杂志刊登了美国威尔康奈尔医学院Rajiv R. Ratan研究组的最新重要工作[6]，他们发现硒抑制神经元铁死亡的分子机制，并开发一种含硒代半胱氨酸的多肽，这种多肽可以有效缓解脑出血及脑缺血卒中小鼠的病症。本篇文章首次揭示硒保护神经元的分子机制，并开发了治疗性多肽，极大提高了人们在脑卒中领域的认知。
Rajiv R. Ratan, M.D., Ph.D.
结果
01
脑出血等铁死亡刺激上调保护性硒蛋白的转录水平
首先，为探究铁死亡刺激对多基因转录水平的调节作用，作者使用培养的原代皮层神经元，将HCA或Hemin作用于神经元6h以诱导铁死亡，并通过qPCR手段检测各种抗氧化酶的转录水平。他们发现，两种铁死亡刺激均引起GPX4、SELP、TXNRD1和GPX3四种硒蛋白转录水平显著上调，其中GPX4的翻译水平亦显著上调（图1A, B, E）。他们又引入在体实验，在小鼠单侧纹状体中注射胶原酶以诱导脑出血，发现注射一侧纹状体中GPX4、SELP、TXNRD1和GPX3的转录水平在注射胶原酶6h后显著上调（图1C-D）。
为证实GPX4的保护性，作者引入不稳定形式的GPX4——ddGPX4，只有在TMP的作用下，ddGPX4才能稳定表达。他们在神经元中表达ddGPX4，以HCA或Hemin作为铁死亡刺激，发现加入TMP后，神经元存活率显著上升（图1F-G）。作者还引入在体实验，在小鼠的纹状体中注射AAV-esyn-GPX4以实现GPX4的过表达，14天后在同侧纹状体注射胶原酶以诱导脑出血，再过14天检查神经元死亡情况以及动物的行为学表征。他们发现，纹状体神经元过表达GPX4后，神经元死亡率大幅减少，小鼠的感觉忽略与空间忽略症状得到了有效缓解（图1H-J）。
以上结果表明，HCA、Hemin以及脑出血这三种铁死亡刺激上调多种硒蛋白的转录水平，其中GPX4具有神经保护性。
图1 铁死亡刺激上调保护性硒蛋白的转录水平
02
硒处理促进GPX4等保护性硒蛋白的转录反应
研究表明，硒是一种必需的微量营养素，是合成氨基酸硒代半胱氨酸的必需物质[7]。含硒代半胱氨酸的硒蛋白对氧化应激的抗性更强[8]。在培养液中，亚硒酸钠常用作细胞的硒来源[7]。于是，作者以此研究硒是否可以提供神经保护性。
他们发现，亚硒酸钠处理后，HCA或Hemin诱导原代皮层神经元的铁死亡数量显著减少，此现象可维持几个小时之久（图2A-C）。他们还发现，亚硒酸钠处理提高神经元内GPX4等多种硒蛋白的转录水平，而转录抑制剂Act D可阻断硒蛋白转录水平的升高以及神经元的保护效应（图2D-F）。以上结果表明，硒可提高保护性硒蛋白的转录水平以阻止神经元的铁死亡。
接着，为进一步探究GPX4在此过程中的功能，作者通过siRNA沉默GPX4。他们发现，GPX4表达下调后，亚硒酸钠处理不再减少神经元的铁死亡（图2G-H），表明GPX4在亚硒酸钠通过上调硒蛋白转录水平以保护神经元过程中具有必要性。
图2 硒处理促进硒蛋白转录水平以保护神经元
03
硒处理抑制肿瘤细胞铁死亡以及内质网诱导的神经元死亡
前文提到，Erastin可诱导肿瘤细胞铁死亡[5]，为探究硒是否同样参与此过程，作者在小鼠原代层神经元和人类纤维肉瘤细胞培养液中加入亚硒酸钠，发现Erastin诱导神经元以及纤维肉瘤细胞铁死亡数量显著减少，纤维肉瘤细胞中多种硒蛋白转录水平显著增加（图3A-B）。
然后，作者探究硒保护神经元的分子机制。他们使用RNA sequencing手段，探究亚硒酸钠作用下，神经元内差异性表达的基因。他们发现，加入硒后神经元含外显子1a和含外显子1b的GPX4转录水平均显著提高，其中含外显子1a 的GPX4位于线粒体，含外显子1b的GPX4位于细胞核（图3C-D）。在加入硒的条件下，线粒体和细胞核中GPX4表达水平均显著升高（图3E-F），表明细胞核和线粒体中的GPX4均参与硒对神经元的保护作用。
为系统化RNA sequencing分析结果，作者引入加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法[9]以探究与线粒体GPX4共调节的基因，发现多种神经保护性基因表达水平上调（图3G-H）。此外，硒处理也参与内质网应激诱导的神经元死亡（图3I）。
图3 硒处理抑制肿瘤细胞铁死亡以及内质网诱导的神经元死亡
04
硒处理通过转录因子TFAP2c和Sp1上调GPX4表达
接下来，作者研究GPX4的启动子和上游调节域以探索硒调控GPX4等硒蛋白转录水平的分子机制。他们通过靶向敲除方法，发现GPX4基因-1,189到-1,467 bp亚结构域对硒诱导启动子活性至关重要，此结构域中5个基序与转录因子AP-2（TFAP-2）家族的结合位点相似，其中3个基序突变即可阻断硒的作用（图4A-C）。
研究表明，TFAP-2家族在人类和小鼠中高度保守，共有5种亚型（TFAP2a-e）[10]。其中，只有TFAP2c存在于小鼠原代神经元。作者引入染色质免疫共沉淀方法（ChIP），发现硒处理显著增强TFAP2c与GPX4基因-1,189到-1,467 bp亚结构域的结合作用，此结合作用在硒处理4小时后最强（图4D, F）。前文提到，硒处理至少可作用6小时，表明其它转录因子亦参与此过程。
在其它基因中，TFAP2c的结合位点与Sp1有共标[11]，表明Sp1可能参与硒处理4小时以后的转录调控作用。ChIP结果显示，硒处理显著增强Sp1与GPX4基因-1,189到-1,467 bp亚结构域的结合作用，此结合作用在硒处理6小时后最强（图4E-F），证实了上述假设。作者还引入缺乏TFAP2c结合域的GPX4基因，进一步证实TFAP2c和Sp1在硒处理诱导神经保护性中的作用（图4G-H）。此外，过表达TFAP2c或Sp1促进原代皮层神经元中铁死亡相关硒蛋白的表达（图4I-K）。
综上所述，硒处理通过转录因子TFAP2c和Sp1上调GPX4等硒蛋白表达，进而产生神经元保护性。
图4 硒处理通过转录因子TFAP2c和Sp1上调GPX4表达
05
脑室内注射硒上调Sp1和GPX4表达并促进功能恢复
在探究硒处理在离体神经元中的分子机制之后，作者就其在体功能展开进一步研究。他们在小鼠纹状体中注射胶原酶诱导脑出血模型，一定时间后在小鼠脑室中注射亚硒酸钠，并通过qPCR探究胶原酶注射处各基因转录水平（图5A）。他们发现，硒处理后GPX4等硒蛋白转录水平显著上调（图5B-C）。他们还发现，在纹状体注射胶原酶2小时后在脑室中注射亚硒酸钠，小鼠神经元死亡率显著降低，血肿面积显著减少，感觉忽略与空间忽略症状亦得到了显著缓解（图5D-H）。免疫荧光结果显示，硒处理后7天，小鼠纹状体中Sp1和GPX4的表达水平均显著增加（图5I-J），表明Sp1和GPX4在小鼠纹状体神经元中已参与硒处理的保护性作用。
图5 脑室内注射硒上调Sp1和GPX4表达并促进功能恢复
06
Tat SelPep上调Sp1和GPX4表达并促进功能恢复
尽管上文结果显示，脑室内注射硒可缓解脑出血带来的继发性铁死亡。但是，临床实验在人体实施脑室内注射会造成脑损伤，且很可能引起感染。更重要的一点是，硒处理的作用浓度非常难把握，只在0.5-1 μM疗效较好（图6A）。
为解决此问题，作者引入一种多肽——Tat SelPep，这种多肽包含硒代半胱氨酸，且可通过血脑屏障[12]。在原代皮层神经元培养液中加入Tat SelPep后，Hemin诱导的铁死亡现象显著减少，且作用浓度比较广——大于1μM即可（图6B-D）。qPCR结果显示，Tat SelPep可上调GPX4等多种硒蛋白的转录水平，且Sp1参与此过程（图6E）。
接着，是在体验证实验。作者在小鼠纹状体中注射AAV-esyn-mSp1以在纹状体神经元中过表达Sp1突变体（mSp1）以抑制Sp1活性，13天后在相同位置注射胶原酶以诱导脑出血模型，2小时或6小时在小鼠腹腔中注射Tat SelPep（图6F，J）。他们发现，Tat SelPep作用可缓解小鼠感觉忽略与空间忽略症状，而抑制Sp1活性后这些症状不再缓解（图6G-H，J-K）。
以上结果表明，和硒相比，Tat SelPep具有更好的疗效以及更广的应用空间。
图6 Tat SelPep上调Sp1和GPX4表达并促进功能恢复
07
Tat SelPep减少缺血性卒中模型鼠的脑梗死体积
最后，作者探究Tat SelPep在缺血性卒中模型鼠中是否具有相同功能。他们结扎小鼠大脑中动脉45分钟以诱导缺血性卒中模型，2小时后腹腔注射Tat SelPep（图7A）。他们发现注射Tat SelPep后，小鼠脑梗死体积显著减少（图7B-C），表明Tat SelPep在缺血性卒中模型中同样具有神经保护性。
总结
图8 脑出血模型中Tat SelPep保护神经元的分子机制
OBiO
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参考文献