谁来调控我感兴趣的DNA？100%可行的全面解决方案V2.0
耐心读完，消化，实践，修炼成转录调控专家。
上一篇解决的问题：
转录因子调控了谁？本质是蛋白质对DNA的调控。此处"DNA"包括能够翻译成蛋白质的蛋白编码基因、能够转录成lncRNA/circRNA/miRNA的基因
这篇解决的问题：
谁来调控我感兴趣的基因？本篇从转录水平研究。本质是蛋白质/RNA对DNA的调控。下篇重点讲转录后水平的研究方案。
下一篇要解决的问题：
ncRNA向下调控了谁？
转录水平，ncRNA基因受谁调控
转录后，ncRNA受谁调控
本质是RNA对DNA/RNA/蛋白质的调控、蛋白质对RNA的调控。人们发现了大量非编码RNA（ncRNA）具有调控作用，本文ncRNA包括lncRNA、circRNA、miRNA
谁来调控我感兴趣的DNA？
本文关心的是直接调控，即哪个蛋白/RNA直接结合我感兴趣的DNA。研究哪个蛋白质结合某段DNA，有两种方法screen：
Plan A：大量ChIP-seq公共数据
Plan B：motif分析预测
研究哪个RNA直接结合某段DNA，可以通过大量的ChiRP-seq数据分析解决。目前人的ChiRP-seq数据不足100套，随着数据的积累，也会像下面介绍的Plan A一样，找到结合DNA的RNA。
本文最后会介绍一下低通量的实验验证方法。
Plan A：基于大量ChIP-seq公共数据
目前全世界已发表人和小鼠的2万多套ChIP-seq数据，包含800多个TF，把这些ChIP-seq数据放在一起，就能看到基因组的每个位置都结合了哪些TF。
进入UCSC 能查询到ENCODE产生的167个TF和组蛋白修饰的ChIP-seq数据。ENCODE介绍视频 | 由ENCODE成员翁志萍教授亲自讲解
https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway，一定选择hg19版本。如果进入hg38，是看不到ENCODE数据的，因为跑ENCODE数据时用的是hg19。GO
找到Regulation，点击ENC TF binding...，show，refresh
refresh后，就能看到这段DNA范围内有结合信号peak的TF，例如NFYA、E2F1等。
左侧依次是细胞系的名字和TF的名字。
如果不巧，是167个以外的某个TF对我的这段DNA起了关键的调控作用，不就看不到了吗？说好的800多个TF的20000套ChIP-seq数据呢？如何查看呢？
这就要用到上篇提到的CistromeDB。CistromeDB提供了批量下载功能，http://cistrome.org/db/#/
点击右上角的“Batch download”，填写课题组信息，勾选要下载的数据类型
承诺提交的信息正确，不会把下载到的数据交给别人，发表文章的时候引用该论文。输入校验码，点击最下面的按钮，就开始下载了。
用bedtools找出感兴趣的基因附近有结合信号peak的ChIP-seq数据，对应到TF名字，就推测出哪些TF结合了感兴趣的基因。bedtools的用法满天飞，小哈在这里不啰嗦。
该方法的优点是，找到的TF跟DNA关系是有in vivo实验证据的；缺点是，基因的转录调控有着组织特异性，在这套ChIP-seq数据的细胞类型和处理条件下不结合，不代表你关心的细胞类型或处理条件下也不结合，有可能真就能结合呢！反之亦然。
Plan B：基于motif预测
通过motif预测DNA上可能会有哪些转录因子结合。每个转录因子都有一个DNA结合结构域（DBD），喜欢结合在特定DNA序列上，也就是motif。如果我感兴趣的基因上游DNA有某个TF的motif，那么该TF就有可能结合这段DNA，从而调控下游基因表达。
进入UCSC，https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway，找到Regulation，点击TFBS Conserved，full，refresh
refresh后，这段DNA范围内有motif的TF名字就出现在左侧
点击名字，出现motif信息
该方法的缺点是，就算在DNA序列上找到了TF对应的motif，并且用EMSA实验验证是阳性，该TF不一定真的就能in vivo结合这段DNA。这起码提供了一条线索，让你有迹可循，看到了某个感兴趣的TF的motif，就做个ChIP-qPCR验证一下吧！
低通量实验验证蛋白质-DNA结合
ChIP-qPCR，验证细胞内真实存在的某个蛋白质与某段DNA的结合情况。如果蛋白质跟这段DNA结合，加蛋白质的抗体就能拉下这段DNA，对照组不加抗体。在这段DNA上设计引物，做qPCR，ChIP样品里该段DNA的扩增产物会远高于对照。缺点是，ChIP实验对技术要求高，不一定有好用的抗体。
EMSA，又叫Gel shift assay，凝胶迁移滞后实验。跑电泳时，DNA/RNA自己像老鼠，跑得快；如果DNA/RNA背上蛋白质，像大象，跑的慢。优点是检测对象是DNA，不需要蛋白质的抗体，缺点是不能代表细胞内的真实结合情况。
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=p0547zqeqo7&width=500&height=375&auto=0
DNA footprinting，裸露的DNA被DNase随机切成长短不一的片段；如果某段DNA上结合了蛋白质，就不会被DNase切到。跑胶，理想状态是对照组DNA样品在胶里是均匀分布的；蛋白质保护DNA不被酶切，导致结合了蛋白质的样品中间会空一块。理想很丰满，现实是DNA上已经结合的调控蛋白形成DHS，以及酶本身的bias，导致对照组就不是均匀分布。
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=c0547afbgxr&width=500&height=375&auto=0
另外，RNA footprinting，研究蛋白质与RNA的结合，原理类似于DNA footprinting，发表在2014年的Genome Biology上。缺点是技术难度大。
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