中国团队开辟mRNA新冠疫苗全新领域

近日，复旦大学生命学院林金钟教授联合上海交大、厦门大学、上海蓝鹊生物医药有限公司（蓝鹊生物）等团队，在《Cell Research》杂志上在线发表题目为“A COVID-19 mRNA vaccine encoding SARS-CoV-2 virus-like particles induces a strong antiviral-like immune response in mice”的文章。该研究利用蓝鹊生物高通量mRNA合成筛选平台，设计了多种针对新冠的mRNA疫苗方案，检测了小鼠免疫后的效果，并特别提出用mRNA表达的新冠病毒样颗粒，可以诱导产生最强的特异专一的免疫反应。这也是全世界首个使用mRNA技术进行体内表达新冠病毒样颗粒，并且完成概念疫苗验证的研究，开辟了新冠mRNA疫苗开发的全新领域。

由于新冠病毒本身的特殊性，用mRNA表达哪种抗原，既能够快速有效激活免疫系统，同时又不会引发非特异性的不良免疫反应，仍然需要后续大量实验来验证。这篇文章除了用mRNA表达S蛋白RBD结构域和S蛋白全长，还选用了更为复杂的多个mRNA共表达蛋白技术，用来表达新冠病毒样颗粒，并系统比较了这三种方案在小鼠免疫中的表现。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-020-00392-7

研究方法

林金钟团队继2月底国际上首次报道利用mRNA技术体外得到病毒样颗粒的结果后，系统研究了mRNA序列和修饰优化对新冠蛋白表达的重要作用，利用蓝鹊生物独有的mRNA VLP技术平台，进一步进行mRNA疫苗筛选，并在小鼠体内进行验证。

在此次研究中，作者设计了三种候选的COVID-19 mRNA疫苗，分别编码不同的抗原蛋白（图1, a），寻找和病毒本身最接近，最能有效激活免疫系统的疫苗候选方案：

1. RQ3011-RBD—编码SARS-CoV-2的spike (S)糖蛋白(残基331-524)的受体结合区域(RBD) 

2. RQ3012-Spike—编码全长的野生型S蛋白。

3. RQ3013-VLP—编码三种包膜蛋白S、M、E，并最终由这三种蛋白在体内自组装成新冠病毒样颗粒。病毒样颗粒（Virus Like Particles，简称VLP）就是外表类似病毒的颗粒，具有完整的病毒衣壳和新冠特有的棘突，但不包含病毒的任何遗传信息，不能进行复制，本身完全无毒。

为了提高mRNA疫苗的表达能力，所有mRNA都经过了优化:  DNA模板中的密码子和在mRNA合成中加入修饰核苷酸。值得注意的是，优化后Spike全长蛋白表达达到预期。之前Moderna公司和BioNTech的mRNA疫苗均选用了表达全长S蛋白的mRNA。表达全长S蛋白的mRNA超过6kb，对mRNA扩增也提出了挑战。团队经过对体外转录体系的优化，目前可完成10kb以上超长mRNA片段的转录。对于M和E这两个相对较小的蛋白质，作者分别为它们设计了一个密码子优化序列，并筛选出修饰核苷酸的最佳选择。疫苗中的最终mRNA都具有密码子和修饰过的核苷酸的最佳组合，可给予最稳定的表达

对SARS和MERS的研究表明，冠状病毒VLP组装至少需要三个结构蛋白:  S、M和E。因此，作者以1:2:2的摩尔比将编码SARS-CoV-2 S、M和E的三种mRNA共转染到细胞中。经过检测和观察，VLPs的平均直径为100纳米，表面有密集的穗状蛋白，表明已经形成了SARS-CoV-2病毒样颗粒（图1，b）。

图1. a. 三种mRNA疫苗设计方案。

图1.b. 用mRNA疫苗表达的病毒样颗粒（VLP，电镜照片），与天然病毒极为相似。

研究结果

通过比较mRNA序列和修饰方式对蛋白翻译的影响，对几种mRNA疫苗做了系统性的优化和筛选，从上百种候选方案中，选取了表达量最高、注射剂量相对较低的mRNA疫苗进行动物免疫。随后，比较了这几种mRNA疫苗在小鼠中诱导中和抗体的情况。

实验结果表明，利用mRNA表达病毒样颗粒，可以在小鼠体内诱导产生最强的免疫反应。

RQ3012-Spike（疫苗只编码S蛋白）和RQ3013-VLP（疫苗产生病毒样颗粒）含有相同数量的S  mRNA。只有RQ3013-VLP，同时引起体液和T细胞免疫应答。它还产生了最高滴度的NAbs，这表明当S以VLPs的形式出现在囊泡的分泌中时，它比在细胞膜上显示时诱发了更强的免疫反应。RQ3013-VLP引发的抗病毒样免疫与之前的发现一致，即VLPs可以模拟真正的原始病毒的抗原特性。

RQ3013-VLP（疫苗产生病毒样颗粒）在小鼠体内诱导出的中和抗体，首次注射在4周后，已达到疫苗RQ3012-Spike（疫苗只编码S蛋白）诱导的中和抗体的2.5倍，并具有显著差异。并且疫苗RQ3013-VLP产生的中和抗体在注射8周后，仍在持续上升，显示了这种疫苗可能会提供长效保护机制。(图2)

图2. a.小鼠免疫示意图。

图2.f.g.不同mRNA疫苗产生免疫反应强弱有显著差别，病毒样颗粒（VLP）mRNA疫苗能产生最多的免疫球蛋白IgG和有效中和抗体。

总结展望

因为病毒样颗粒（VLP）与病毒形态最接近，在体内稳定性优于单独的S蛋白。病毒样颗粒如同用mRNA方法给新冠病毒精准画像，从而保证了免疫系统能够正确识别真正的病毒。同时病毒样颗粒的组成成分，可通过mRNA编码和比例进行调控，在应对病毒突变方面更具有优势。通过同时表达SARS-CoV-2 的S、M和E三个蛋白，并组装成病毒样颗粒 (VLP)。这种多个mRNA表达蛋白的技术，也可以应用到其他疫苗和新药领域。mRNA诱导产生病毒样颗粒作为疫苗的优势，为后续临床实验打下了坚实基础，同时也为打造安全高效、可应对多种变化的新型疫苗提供了新方向。

目前已经在进行临床实验的国外mRNA疫苗包括美国Moderna公司的mRNA-1273，以及辉瑞联合德国BioNTech的BNT162b2，这两种mRNA疫苗均通过修饰后的mRNA表达新冠S蛋白全长，来激活免疫系统。就目前公开的信息来看， mRNA-1273的定价为平均每支32-37美元，  BNT162b2的定价为平均每支19.5美元。

在过去十几年间，像Moderna和BioNTech这样的国外mRNA药物开发的龙头企业，在技术和资本上进行积累，将科研和产业化深度结合，在该领域内做了大量的基础性工作，并且掌握了相对成熟的生产工艺，拥有自主的原材料生产。

而相比国外长期的技术积累，我国mRNA领域研究发展较为缓慢。国内近年来少有人从事mRNA翻译机制研究，并且缺少原材料，mRNA体外合成核心原料基本全部依赖进口，再加上mRNA生产工艺和药物制剂工艺缺乏等，使得国内的mRNA药物产业化面临重重挑战。

为了打破国内mRNA药物产业化瓶颈，蓝鹊生物经过艰苦努力，突破国外mRNA原料壁垒，已经可以自主研发生产mRNA制备的核心原料（加帽类似物和修饰核苷酸等），拥有亚洲唯一完整mRNA产品线。

a. mRNA单批次合成量达到国内领先的百毫克水平

b. mRNA生产长度达到10kb以上

c. 操控多条mRNA体内同时表达，实现复杂病毒样颗粒疫苗配方

d.从底层原料出发，解决国内mRNA新药开发“卡脖子”难题

来源：mRNA

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