新冠可写入人类基因组，成为永不灭亡的病毒？
作者 | 华中农大CX
COVID-19自爆发以来，不断有研究发现，在初次感染康复后几周到几个月后，核酸检测依然有“反阳”的情况发生，而在排除严格的隔离措施以及无法分离到病毒颗粒的“再感染”情况下，许多案例中表现的这种核酸检测“复阳”情况原因依然未知。
2020年12月13日，来自麻省理工学院（MIT）Rudolf Jaenisch（通讯）、哈佛（Harvard）大学以及怀特黑德（Whitehead）生物医学研究所的科研人员发现：SARS-CoV-2 RNA可以被逆转录并整合到人类基因组中，整合后新序列的再转录解释了复查PCR阳性结果出现的原因。而核衣壳N因具有最丰富的RNA序列而极有可能成为逆转录和整合的靶点。以上数据也为COVID-19 RNA病毒复制提供了一种可能的新途径。相关研究发表在预印版平台bioRxiv，请参考
https://doi.org/10.1101/2020.12.12.422516
1. 病毒细胞嵌合转录本在受感染的培养细胞和患者来源的细胞中的表达与整合病毒序列的基因组是一致的。
为了研究病毒整合到病毒感染细胞中的可能性，研究人员分析了已发表的来自SARS-CoV-2感染细胞的RNA-seq（转录组）数据，以获得嵌合转录本的证据，这将表明病毒整合到基因组中并发生表达。结果显示，这些数据集中有大量的宿主-病毒嵌合阅读。
而这些阅读在多种样本类型中被发现，包括来自肺/心脏/脑/胃器官和组织的细胞，以及从COVID-19患者直接分离的BALF细胞（支气管肺泡灌洗液细胞）。且嵌合阅读丰度与整个样本类型的病毒RNA水平呈正相关。嵌合阅读量约占整个样本中SARS-CoV-2阅读总量的0.004%-0.14%，来自严重COVID19患者的支气管肺泡灌洗液细胞的最大读取数为69.24%，几乎没有来自患者血涂层细胞的嵌合阅读(几乎没有SARS-CoV-2阅读)。
大多数嵌合阅读映射到SARS-CoV-2核衣壳(N)序列。这与核衣壳(N)RNA是最丰富的SARS-CoV-2亚基因组的发现是一致的，因此最有可能成为逆转录和整合的靶点。以上数据充分证明，SARS-CoV-2RNA可能会重新整合到感染细胞的基因组中，从而产生嵌合的病毒-细胞转录本。
2. SARS-CoV-2 RNA可以逆转录并整合到过量表达逆转录酶的细胞的人类基因组中
紧接着，为验证SARS-CoV-2 RNA的逆转录和整合的证据，实验人员在HEK293T细胞中过表达人LINE-1或HIV-1逆转录酶（reversetranscriptase, RT），并用SARS-CoV-2感染转导的细胞。
感染后2天，通过PCR或荧光原位杂交（FISH）测试细胞的病毒序列。考虑到N RNA是SARS-CoV-2最丰富的亚基因组RNA，并且最有可能被逆向整合，实验人员选择了四个用于COVID- 19个测试的引物来源。纯化的细胞DNA的PCR扩增结果显示，在具有人LINE-1或HIV-1 RT过表达的细胞中出现阳性凝胶带，而在未转染或未感染的细胞中则没有。
为了测试N序列的DNA拷贝是否已整合到细胞基因组中，研究人员进行了凝胶纯化的细胞基因组DNA。qPCR结果证实了细胞的gDNA中的N序列的存在。由CMV启动子驱动的LINE-1具有强RT表达的细胞检测显示，约8倍强度的N序列信号被检测到，表明整合的N序列的拷贝数比由其自然启动子驱动的LINE-1表达的细胞更高。
进一步，实验人员使用靶向N的荧光团标记的寡核苷酸探针进行单分子RNA-FISH（smRNA-FISH），以确认病毒N序列已整合至宿主基因组中及其转录水平。结果显示，SARS-CoV-2感染的细胞显示了预期的N RNA胞质FISH信号，这表明SARS-CoV-2 N RNA通过细胞内源性RT活性整合。
3. SARS-CoV-2感染和细胞因子诱导的人类内源性LINE-1表达与逆转录整合相关
众所周知，人LINE-1元件是编码逆转录酶和支持蛋白的自主逆转座子，也有助于非自主元件进行逆转座。科研人员发现，感染SARS-CoV-2后，LINE-1元件的表达在已发表的细胞RNA-Seq数据中显着上调，并与嵌合阅读丰度相关。使用LINE-1特异性引物进行的表达分析显示，在SARS-CoV-2感染后，Calu3细胞中LINE-1的上调约3-4倍。此外，对Calu3细胞DNA的PCR分析显示，感染后SARS-CoV-2 N序列可能会被激活的LINE-1逆转录酶逆向整合。
科研人员进一步用来自髓样，小胶质细胞或CAR-T细胞培养物的含细胞因子的条件培养基处理细胞，PCR结果发现内源性LINE-1表达有约2-3倍的上调表达。以上结果表明，在病毒感染或暴露于细胞因子的细胞中，LINE-1的表达受到诱导，这揭示了SARS-CoV-2在人类细胞中逆向整合的分子机制。
综上所述，SARS-CoV-2感染患者的培养细胞和原代细胞中存在由病毒融合至细胞序列的嵌合转录本。SARS-CoV-2RNA可以通过LINE-1元件的逆转录酶（RT）或HIV-1 RT在人类细胞中被逆转录，并且这些DNA序列可以整合到细胞基因组中并再次发生转录。人内源性LINE-1表达是在SARS-CoV-2感染或暴露于细胞因子的培养细胞中被诱导的，提示了患者SARS-CoV-2逆向整合的分子机制。SARS-CoV-2感染的这一新颖特征解释了为什么患者在康复后仍可以继续产生病毒RNA，并提出了RNA病毒复制的新思路。
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