【成功案例】CRISPR-Cas9如何检测编辑效率
继上一次军事医学科学院疾病预防控制所宋宏彬课题组与百迈客合作，利用全基因组重测序技术检测CRISPR-Cas9切除HBV稳转细胞模型中全长整合HBV DNA脱靶效应（相关链接：我国科学家利用CRISPR-Cas9技术清除整合HBV DNA）。武汉大学基础医学院又与百迈客合作，利用PCR产物高通量测序技术检测CRISPR-Cas9编辑HIV协同受体CCR5和CXCR4编辑效率，助力于HIV基因疗法研究。
下面小编将为老师们奉上该研究的解读，文章信息如下：
中文名：CRISPR-Cas9编辑HIV协同受体CCR5和CXCR4保护CD4 + T细胞免受HIV-1感染
英文名：Genome editing of the HIV co-receptors CCR5 and CXCR4 by CRISPR-Cas9 protects CD4+ T cells from HIV-1 infection
杂志：Cell and Bioscience， 2017
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研究背景
治疗HIV-1感染的主要方法是联合抗逆转录病毒疗法（cART），尽管cART在减少HIV-1病毒载量和控制疾病进展方面是有效的，但具有许多副作用，并且对于HIV-1感染的患者保持终身治疗很昂贵。之前的研究表明CRISPR-Cas9被用于成功地破坏HIV-1协同受体CCR5或CXCR4，从而限制HIV -1感染。然而，CRISPR-Cas9同时编辑CXCR4和CCR5在阻断原发性CD4 + T细胞中的HIV-1感染方面很少报道。
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研究思路
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研究结果
1、构建同时靶向CXCR4和CCR5的CRISPR-Cas9载体
针对CXCR4设计了2种不同的sgRNA（sgRX4-1和sgRX4-2）分别与1种sgRNA靶向CCR5基因sgR5，组合构建在同一个载体，称为lenti-X4R5-Cas9-#1(或#1)以及lenti-X4R5-Cas9-#2 (或#2)。
靶向CXCR4和CCR5的CRISPR-Cas9载体示意图
2、TZM-bl细胞模型基因编辑效率及表型分析
TZM-bl 细胞是一种携带有荧光素酶报告基因的传代细胞系，表面表达协同受体CCR5和CXCR4，并且该报告基因受HIV-1 tat原件调控，只有在HIV-1 Tat蛋白存在的情况下才能有效表达。利用HIV-1病毒感染该细胞后，表达Tat蛋白，从而上调荧光素酶基因表达，继而通过检测荧光素酶的表达情况以判断HIV-1的感染与复制效率。
将上述2种载体（#1和#2）转染TZM-bl 细胞系，采用T7E1酶切法突变体检测试验检测CRISPR/Cas9的target sites编辑效率，并用流式检测了编辑后TZM-bl 细胞系表面CXCR4和CCR5的表达，结果表明2种载体均能够对靶基因有效编辑。采用引物扩增靶向区域，进行PCR产物高通量测序，发现编辑后产生明显的随机InDel突变。随后，HIV-1NL4-3毒株（X4-tropic）和HIV-1YU-2毒株（R5-tropic）感染被编辑的TZM-bl细胞系，用双荧光素酶报告基因试验检测HIV的感染水平，结果表明CXCR4和CCR5被敲减后赋予2种HIV毒株感染抗性。
TZM-bl系T7E1试验检测DNA编辑效率&流式检测蛋白敲减效率
TZM-bl系On-target区PCR产物NGS序列分析
TZM-bl系HIV感染能力鉴定
3、Jurkat T细胞系基因编辑效率及表型分析
急性T细胞白血病（ATCL）衍生的Jurkat T细胞，是一种和人原代CD4 + T细胞一样在表面表达HIV协同受体CXCR4和CCR5的悬浮细胞。因此，利用设计的同时打靶CXCR4和CCR5的CRISPR-Cas9表达载体#1和#2转染该细胞系，T7E1试验和PCR产物深度测序检测编辑效率表明可以成功编辑靶基因，流式和Western Blot实验发现敲减后靶基因蛋白表达降低，分别用2种HIV毒株感染敲减双基因后的Jurkat T细胞系，与对照相比，ELISA试验检测到的HIV核心抗原p24显著减少，表明构建的#1和#2可以敲减Jurkat T细胞系中CXCR4和CCR5，而使其具有HIV感染抗性。接下来，利用2种HIV毒株持续共同感染Jurkat T细胞系18天，相比对照组细胞系，随时间延长CIRSPR编辑组p24抗原轻微降低，且编辑组T7E1试验检测到基因编辑产物增加，表明随时间的延长发生编辑的细胞被富集，呈现出一种选择性优势。
Jurkat T细胞系2种HIV毒株持续感染实验分析选择性优势
4、人原代CD4+ T细胞基因编辑效率、表型分析以及脱靶检测
人类原代CD4+ T细胞是HIV-1感染的主要目标，因此用lenti-X4R5-Cas9-#1以及lenti-X4R5-Cas9-#2以电穿孔方式转染分离得到的原代CD4+ T细胞系，T7EI试验和PCR产物深度测序表明靶基因CXCR4和CCR5得到有效编辑。同样，编辑细胞系HIV感染后p24抗原显著降低，共同感染HIV-1 2种毒株，较单独编辑CXCR4或CCR5组以及对照组同时编辑CXCR4和CCR5组p24抗原显著降低，表明同时敲减CXCR4和CCR5抗病毒感染能力更好。利用PCR产物高通量测序或T7EI等试验检测可能的脱靶区域indel突变，结果表明无明显的脱靶效应。流式细胞实验表明，与对照组相比，lenti-X4R5-Cas9介导的CD4 + T细胞CXCR4和CCR5敲减没有造成显著凋亡产生（转染5天内）。
人原代CD4+ T细胞系CRISPR编辑效率检测及HIV感染抗原检测
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研究结论
通过CRISPR-Cas9同时进行的CXCR4和CCR5基因组编辑，可以为HIV-1感染的功能性治疗提供有效且安全的策略。
正在利用CRISPR-Cas9技术开展研究的老师们，不可忽视的是基因编辑效率及脱靶检测（由于序列相似性而产生的非特异性切割，造成靶点以外的区域发生突变），怎么检测编辑效率与脱靶效应呢？找百迈客，百迈客可以提供全基因组重测序WGS与PCR产物高通量测序服务，有效检测靶基因编辑效率及脱靶效应，使您的基因编辑更精准可靠。
医学事业部 时韦美 | 文案
时韦美 | 审核
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