疾病分子标志物研究分享篇之外泌体RNA
有没有想研究疾病分子标志物的同鞋？有想研究的请举手。。。
好的，小编有千里眼，已经看到了举手的同鞋们。现在就给举手的同鞋们分享一篇外泌体小RNA作为疾病分子标志物的研究，以期能够为各位同鞋日后课题设计提供思路。
外泌体是个啥？
外泌体(exosomes)是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径约40-100nm，含有丰富的蛋白质、脂类、核酸（mRNA;lncRNA;miRNA;circRNA等），表面有特异性蛋白、表面受体等，广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中。外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等；不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物；外泌体具有脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种很好的靶向给药系统。
英文题目：Global exosome transcriptome profiling reveals biomarkers for multiple sclerosis
中文题目：外泌体全转录组测序鉴定多发性硬化症分子标志物
发表杂志：Annals of neurology， 2017
影响因子：9.89
研究背景
多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）是一种复杂的疾病，以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，具有不同的临床症状，诊断程序复杂，需要寻找简单快速可靠的诊断方法。如上所述，近来研究发现外泌体在免疫过程中发挥作用，小RNA是其中最有前景的外泌体分子标志物之一。
样本入选标准
根据修订后的McDonald标准，实验组：未经治疗的复发缓解型多发性硬化症（relapsing remitting MS，RRMS）患者；对照组：选择与MS患者年龄和性别相匹配的健康人（HCs）。复发relapse被定义为在临床稳定至少30天之后出现新的神经体征或预先存在的体征恶化；缓解期remession患者至少6个月未接受疾病缓解药物治疗。采集5ml肘静脉血液，凝固后离心分离血清，-80℃保存。
技术路线
图1 技术路线
研究结果
1、外泌体分离和鉴定
从复发期RRMS患者、缓解期RRMS患者和健康对照HCs的血清中分离富集外泌体，并通过纳米粒度分析仪检测粒径大小和western blot检测外泌体标志蛋白CD9、Alix鉴定外泌体。3组之间外泌体含量以及外泌体RNA含量无显著差异。血清来源的外泌体RNA主要是短RNA（<300nt），没有检测到18S和28S rRNA。
图2 外泌体RNA长度分布
2、discover set外泌体RNA全转录组测序
如技术路线中所示discovery set包括9例复发期RRMS患者、10例缓解期RRMS患者和10例健康对照HCs，将其外泌体总RNA构建文库（全转录组测序），鉴定的RNA包括miRNA等在内的15种类型，如下图所示。各类型外泌体RNA的平均总序列数和总reads数在3组之间无显著差异。以上表明，确实有很大一部分RNA存在于胞外血清外泌体中。
图3 不同类型外泌体RNA平均总序列数和总reads数
3、MS患者独特的外泌体miRNA表达谱
已证实血清外泌体在细胞之间转运miRNA，故而重点分析了discover set的小RNA表达。最终鉴定了4个在3组间显著差异表达（下文以differentially expressed缩写DE表示）的miRNA：hsa-miR-122-5p, hsa-miR-196b-5p, hsa-miR-301a-3p 和hsa-miR-532-5p。
图4 Top 20 DE miRNA热图及Top 8 DE miRNA
4、4个候选miRNA Validation set验证及ROC曲线分析
通过数字PCR技术在validation set（n=95）验证了4个候选差异表达miRNA，ROC曲线分析表明4个miRNA的AUC值均可以将复发期RRMS与HCs健康对照区分开（hsa-miR-122-5p: 0.878, hsa-miR-196b-5p: 0.866, has-miR-301a-3p: 0.681， hsa-miR-532-5p: 0.800）
图5 ROC曲线分析
5、DE miRNA与MRI表现相关性分析及miRNA间表达相关性分析
根据磁共振成像MRI表现将RRMS患者分为可观察到Gd增强病灶组（Gd阳性/active/Gd(+)）与不可见Gd增强病灶组（Gd阴性/Gd(-)），比较组间4个miRNA的表达量。Gd(+)组4种miRNA的表达量均显著低于Gd(-)组，表明4种miRNA与疾病活动度相关。而后对4种miRNA表达相关性进行分析，hsa-miR-196b-5p, hsa-miR-301a-3p和 hsa-miR-532-5p显著相关（协同互作），hsa-miR-122-5p不与以上其他3个miRNA相关。但hsa-miR-122-5p和hsa-miR-196b-5p组合后特异性敏感性最高，AUC(RRMS relapse vs.HCs)为0.904，AUC(RRMS relapse vs. remission)为0.866。
图6 DE miRNA表达与MRI表现/疾病活动度相关性分析
图7 4种DE miRNA表达相关性分析
6、外泌体miRNA来源分析
由于4种DE miRNA均不是组织特异性的，故而分离PBMCs细胞（9 RRMS relapse vs.10 RRMS remission vs. 9 HCs），体外培养，分离细胞上清中的外泌体以追踪其潜在的来源，结果显示PBMCs分泌的外泌体中均含有4种DE miRNA。促炎因子等刺激处理后，包含hsa-miR-196b-5p, hsa-miR-301a-3p和 hsa-miR-532-5p的外泌体数量显著升高，而不与以上3种miRNA表达相关的hsa-miR-122-5p的分泌则对刺激处理反应较差。RRMS患者分泌的4种miRNA相较于对照HCs显著减少。综上，含有这4种miRNA的外泌体可能来源于PBMC，并且在RRMS患者中分泌显著减少。
7、DE miRNA靶基因预测
4种DE miRNA共有74个靶mRNA，其中最大的一类是转录因子和核酸结合因子，故而这4种miRNA可能通过调控基因表达发挥作用。
图8 DE miRNA靶基因功能分析
小结：
小编特意将整篇文章的脉络总结一下，
血清外泌体分离鉴定>发现阶段少量样本(n=29)全转录组测序>鉴定差异表达miRNA>验证阶段：a.扩大样本量验证(n=95)/临床相关性分析/miRNA表达相关性分析；b.来源分析及体外实验验证（n=28）>DE miRNA共有靶基因及其功能分析。
不难发现，这篇研究整体做的实验并不多，主要在于样本选取和差异表达miRNA的深入分析，如果有数据深度挖掘需求及个性化分析需求（比如ROC曲线分析、组间特定miRNA表达相关性分析、特征选择、随机森林分类器以及各种模型构建）的同鞋们，可以联系我们噢。
医学事业部 时韦美 | 文案
林海军 | 审核
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