单细胞转录组测序那些事儿

又到周五啦，经过一周的工作，相信大家早就期盼着周末的到来了。寒风瑟瑟，冻得小编只想在家窝着躲避寒风的吹袭。但是，在放松之前，当然还是要认真工作的啦～～

言归正传，今天小编想给大家介绍一下关于单细胞转录组测序的相关知识。

什么是单细胞转录组测序？

简单来说，单细胞转录组测序就是利用高通量测序技术对单个细胞进行RNAseq，以此了解单细胞水平的基因表达情况。某个细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。与参考基因组比对，可以得到基因差异表达、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。单细胞转录组最大的优势就在于，它可以明确到细胞间的差异性，可以将某个组织中不同的单细胞分别进行研究，获取更多的样本信息，而不同于对整个组织（bulk）进行探究的普通转录组，对于理解单个细胞的多样性有着明显的局限性。每种组织中有多种类型的细胞，每一种细胞类型有着独特的起源和功能，而每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何与周围的细胞及环境互作，那么把高通量测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源、功能、变异等就有着至关重要的作用。

怎么准备单细胞转录组测序样本？

既然是对单个细胞进行RNAseq，那么在样本准备上，就与普通转录组测序有很大区别了。能够获取质量较高的单细胞样本，是测序的首要任务。分离单细胞的常用方法有流式细胞仪（FACS）、激光捕获显微切割技术及微流控技术等。

有时候由于做普通转录组测序时准备的细胞样本，经磁珠分选或者流式分选后，细胞的存活率不高，不满足普通转录组测序的样本要求，便考虑改做单细胞转录组测序。小编在这里说明一下，如果老师的细胞个数达到10⁵-10⁶个，是满足做普通转录组项目的，细胞个数在1000个至10⁵之间，那么可以满足微量提取RNA，但是细胞个数如果在1000个以下时，只能选用SMART-seq2等单细胞扩增试剂盒扩增后再进行建库测序。

建议想要借助SMART-seq2进行单细胞转录组测序的老师，在样本准备时可参考以下两种方法：

方法一
1	直接将单细胞置于5uL RNase-free无钙镁离子的PBS或超纯水中，勿挂在壁上，确保单细胞浸入液体中，使用0.2ml的PCR管，便于后续扩增反应（送样时写明加入的PBS体积，尽量保证单细胞不携带其他液体）；
2	运输时注意将PCR管放在冻存盒或者其它大的容器内，用棉花、报纸或者固定在PCR板上再用气泡垫包裹，以防止冻裂或碰撞；
3	液氮速冻，干冰运输。

方法二
1	将10.5ul配置好的裂解液加入0.2ml的PCR管，将细胞样本置于裂解液中，取样时无其它液体带入，请保证终体积10.5ul，轻轻旋涡或吹打，室温孵育5分钟充分裂解；
2	运输时注意将PCR管放在冻存盒或者其它大的容器内，用棉花、报纸或者固定在PCR板上再用气泡垫包裹，以防止冻裂或碰撞；
3	液氮速冻，干冰运输。

在实验方面，不同于普通转录组测序的是，单细胞样本是不需要RNA提取的，只需直接对单细胞进行裂解后扩增，质检合格后构建文库上机测序。

单细胞转录组前期目前主要依赖于三种方法：SMART-seq2技术、10×genomics技术及Andeplete技术。    

SMART-seq2技术

可用于单细胞mRNA测序，对RNA质量要求高，RNA降解会引起5’端信息丢失，能够获得RNA全长扩增cDNA产物，打断后全部用于文库构建及测序。

10×genomics技术

可用于单细胞mRNA测序，对RNA质量要求高，RNA降解会引起5’端信息丢失，其一次性能够分离500~10000个细胞，并能够将分离的单个细胞中的微量mRNA通过高效扩增后再进行测序，只能测3'端一小段序列。

Anydeplete技术

可用于单细胞mRNA及LncRNA测序，对RNA质量要求不高，可用于降解性样本测序。

好啦~今天就介绍这些吧，经过小编的说明，是不是对单细胞转录组测序有一个更清晰的概念了呢？老师们有相关的需求或者疑问可以随时与我们联系哦~

提前祝大家周末愉快啦~