空间转录组ST & 单细胞转录组测序联合揭示胰腺导管腺癌的组织结构

传统的普通转录组测序，即bulk RNA-seq，无法解析组织中每个细胞的表达谱，得到是大量多种细胞混合在一起的整体表达谱，对于组织中细胞异质性无能为力。

单细胞转录组测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术的产生，尤其是像10X genomics等高通量单细胞转录组测序技术发展，使得我们能够获取组织内每个细胞的表达情况，从而解析组织内细胞异质性；

但是这些技术遗憾地丢失了基因表达的空间信息，而基因表达的空间特异性对于组织正常行使功能非常重要。因此，科学家们发明了空间转录组测序技术（spatial transcriptomics, ST），来解析组织中基因表达的空间异质性，比如10X Visium空间转录组测序技术。

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接下来小编分享一篇相关的前沿案例，该研究提示我们可以同时进行空间转录组ST和单细胞转录组测序scRNA-seq研究，既能获得单细胞基因表达谱，又能获得空间基因表达谱，二者联合可解析哪些细胞在哪个位置上表达哪些基因。

话到这里，可能大家疑惑比如10X Visium空间转录组测序，一个捕获区约5000个spot，这些spot中是否是单细胞呢，是否10X Visium空间转录组测序等同于获取了约5000个单细胞的空间表达信息？

NO，该平台捕获区中的spot直径为55μm，也就是根据细胞大小每个spot捕获的细胞个数不同。尤其是那些直径比较小的细胞，可以考虑补充10X单细胞转录组测序获得单细胞水平表达数据，再与空间转录组测序相比较，得到各细胞类型或亚群的空间表达信息。

研究背景

scRNA-seq已经在解析肿瘤内转录异质性上发挥了重要功能，但测序前的组织解离导致空间信息丢失，从而限制了我们对肿瘤微环境中细胞相互作用和组织分布的理解；
ISH（in situ hybridization）方法可以揭示某些基因特定区域的空间表达信息，但检测通量低；

最近开发的空间转录组学（ST）方法克服了ISH方法的通量限制，允许使用空间条形码寡脱氧胸苷（polydT）微阵列在整个组织切片上无偏倚高通量地绘制转录本表达分布；ST的主要局限性在于其缺乏单细胞分辨率。每个spot会捕获10–70个细胞的转录组，具体取决于组织中细胞类型。

作者提出ST与scRNA-seq联合，以研究胰腺导管腺癌（PDAC）不同组织区域的精确细胞组成和基因表达情况。

研究方法

• scRNA-seq：PDAC-A、PDAC-B、PDAC-C共计3个患者3个PDAC组织；

• ST：6个患者10张切片，来自于PDAC-A(3张)、PDAC-B(3张)、PDAC-D、PDAC-E、PDAC-F、PDAC-G；
  

• scRNA-seq和ST联合分析：MIA（multimodal intersection analysis, 多模式相交分析），主要基于PDAC-A和PDAC-B分析；
  

• 验证方法：免疫荧光IF、TCGA公共数据挖掘、H&E染色等

研究结果

1、scRNA-seq鉴定PDAC细胞clusters

PDAC-A和PDAC-B肿瘤分别获得了1926和1733个单细胞数据，使用k最近邻算法(k-Nearest Neighbors，KNN)对scRNA-seq数据进行降噪处理，层次聚类分析，共计分别在中鉴定出15个和11个不同的细胞cluster。患者间共有细胞类型的基因表达谱显示出强相关性，验证了对样品间cluster的注释无误。

基于scRNA-seq数据进行CNV分析，以区分癌细胞和非恶性的导管细胞。发现PDAC-A中的2个肿瘤cluster和PDAC-B中肿瘤cluster显示CNV异常，其中chr6 del和B中chr7 amp为PDAC常见CNV。scRNA-seq数据显示：PDAC-A cancer cluster 1特异性高表达TM4SF1，PDAC-A cancer cluster 2特异性高表达S100A4，PDAC-B中cancer cluster特异性高表达TM4SF1，故而进行了免疫荧光双染实验，证实PDAC-A中高表达且互斥染色的2种cancer cluster marker 基因，即存在2种cluster；PDAC-B中KRT19(胰腺导管marker)与TM4SF1共定位，不与S100A4共定位。

结合CNV与转录相关数据，证实A中具有在遗传和转录层面不同的2种cluster。（从上述结果也能看到A和B2个患者间细胞类型组成差异比较大）

2、PDAC空间转录组测序ST

H&E染色鉴定了4个主要区域：癌细胞和结缔组织增生区、非恶性导管上皮区、基质/间质和富含腺泡的正常胰腺组织；PDAC-B组织切片似乎不包含正常的胰腺组织（A和B患者组织学水平也存在差异）。ST：每个spot约捕获20-70个细胞，对spot数据经过PCA和t-SNE降维聚类结果，与组织学区域划分一致----通过ST数据就可以确定切片中不同空间区域。

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3、scRNA-seq & ST MIA多模式相交分析

MIA方法：首先描述细胞类型特异性基因集和组织区域特异性基因集，然后确定它们的重叠是否比偶然预期的高（富集）或低（depleted）-超几何分布检验，生成MIA图谱。PDAC-A中成纤维细胞特异性基因与ST数据癌症区域一组特异性基因显著重叠。尽管scRNA-seq数据导致了成纤维细胞的鉴定，但MIA进一步揭示了这些在癌区域（而非基质区域）中富集，表明scRNA-seq捕获的成纤维细胞代表活化的成纤维细胞。导管上皮区域主要富集导管细胞，而胰腺组织则富含腺泡细胞和内分泌细胞。

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4、导管细胞亚群鉴定和组织区域空间定位

进一步对占比最高的表达KRT19的导管细胞进行亚群分析，鉴定到4个subpopulations：1）高表达APOL1/与缺氧反应相关的基因的导管细胞亚群，包括ERO1A和CA9；2）表达TFF1、TFF2和TFF3的终末导管细胞亚群；3）表达CRISP3和CFTR的泡心细胞导管细胞亚群；4）表达主要组织相容性复合体（MHC）II类基因CD74、HLA-DPA1、HLA-DQA2、HLA-DRA、HLA-DRB1和HLA-DRB5以及补体途径C1S、C4A、C4B、CFB和CFH的抗原呈递导管细胞亚群。

这些肿瘤中抗原呈递性导管细胞可能通过促进T细胞活化而在肿瘤微环境内调节炎症反应中发挥作用。前人scRNA-seq只揭示了终末导管和泡心细胞存在，未发现高表达APOL1/与缺氧反应相关的基因的导管细胞亚群 以及 抗原呈递导管细胞亚群；免疫荧光双染实验发现亚群marker与导管marker KRT19共定位，证实了4种导管细胞亚群的存在。

MIA联合分析：分析导管细胞亚群特异高表达基因和各组织区域特异性高表达基因间重叠基因是否富集或降低，发现PDAC-A中的所有导管亚群都富集在组织的导管区域中；缺氧和终末导管细胞群在癌症区域也显著富集。由于癌症区域氧含量低，癌症区域的导管细胞可能表达缺氧反应基因；缺氧性导管细胞似乎在胰腺组织中显著降低；PDAC-B中的导管亚群全部分布在组织的导管上皮区域中。
 

另外对巨噬细胞和树突状细胞亚群也进行了MIA分析，基于MIA图，这些亚群可能会根据其定位差异在组织中发挥独特作用。PDAC-A巨噬细胞包含2个亚群，其中一个表达与炎症性M1状态相对应的IL1B47，另一个根据其CD163和MS4A4A的表达类似于M2交替激活状态。当用MIA测试这些巨噬细胞亚群在整个组织中的富集时，发现它们似乎在整个组织中具有相反的富集模式：M2样巨噬细胞在导管中最富集，与其作为组织常驻巨噬细胞的功能一致，而M1巨噬细胞在基质和癌区域更富集，反映了这些区域的炎性环境。作者还发现了树突状细胞的两个亚群A和B，其中亚群B表达了更高水平的补体途径基因和II类MHC；树突状细胞亚群A在胰腺组织中含量最高，而亚群B在组织导管中含量最高。

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5、PDAC切片癌症亚群图谱

PDAC-A中富集于癌症区域的2个在遗传和转录层面不同的细胞cluster，是否与其他细胞存在共定位？作者对PDAC-A肿瘤分割成三部分，每部分又分割成2部分分别进行scRNA-seq和ST。为解决上述问题作者比较了整个PDAC-A不同区域，分析了各个PDAC-A样品区域特异的基因列表之间的重叠，并在整个ST数据集的癌症和基质区域之间发现了明显的重叠。

对于每个组织切片中癌症细胞富集区域，使用层次聚类分析进一步将癌症丰富的区域划分为转录一致的子区域。同样利用MIA方法分析了不同细胞类型和细胞亚群特异基因与不同癌症子区域特异基因间重叠是否显著富集（过高）或降低。在PDAC-A-1样品的癌症子区域2中，只有cancer cluster1和成纤维细胞富集。在3个PDAC-A组织切片中一致观察到，成纤维细胞富集在cancer cluster 1高度富集但cancer cluster 2微弱或没有富集的组织区域。表明，cancer cluster 1细胞可能在组织与特定的基质反应，或者cancer cluster 2细胞与组织中的成纤维细胞互斥。
 

6、解析肿瘤微环境中癌细胞状态及其与其他细胞类型间关系

作者使用MIA方法将癌细胞状态映射到不同的空间组织区域并表征它们与其他细胞类型的相互作用。为此，作者对另外一个PDAC-C进行scRNA-seq，共计3个样本的数据进行NMF降维分析，得到3个基因表达模块，注释为：缺氧响应模块、氧化磷酸化模块和应激反应模块。作者关注到之前研究过的应激反应模块基因，并且该模块中的几个基因已表明参与细胞生长和侵袭性表型的调控，这暗示了该基因模块在肿瘤进展中的作用。

为用MIA研究应激反应癌细胞的状态，首先鉴定应激模块高表达的spot区域特异性表达基因：1）根据应激反应模块的高表达和低表达将ST癌症区域spot分成2组。2）确定在该癌症子区域中特异性表达的基因。使用MIA将它们与细胞类型特异性基因相交。作者发现了炎性成纤维细胞的富集在应激反应模块基因高表达的spots：共计6个患者的10个ST阵列，3个PDAC-A肿瘤样本，3个PDAC-B肿瘤样本，以及4个来自其他PDAC的肿瘤样本；且应激反应模块高表达区域中单核细胞和T细胞/天然杀伤细胞显著富集，尽管这些富集不如炎症性成纤维细胞富集强或稳定。

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作者认为，如果应激反应性癌细胞与炎性成纤维细胞的共定位反映了这些细胞之间的功能关系，则在整个肿瘤水平上也应可检测到相关性。通过对TCGA PDAC bulk转录组数据分析，显示炎性成纤维细胞标志基因仅与应激反应模块显著正相关。通过用KRT19对癌细胞进行免疫荧光染色，发现PDAC微环境主要由炎症性成纤维细胞分泌的IL-6与恶性细胞之间共定位。通过对与免疫荧光切片相邻的组织切片进行H＆E染色，确认整个组织切片的上皮细胞确实为恶性癌细胞。炎性成纤维细胞和表达应激反应基因模块的癌细胞之间存在互作关系。

最后，作者试图通过使用MIA方法重新分析可公开获得的数据来建立其他类型肿瘤的MIA图。在研究转移性黑色素瘤肿瘤时，首先分析了Tirosh等人的scRNA-seq数据解析细胞类型和亚群。使用Tirosh等人包含的标记基因，鉴定了3个T细胞亚群。对来自Thrane等分析的2名患者的黑色素瘤淋巴结转移的ST数据进行了聚类，发现组织组织学注释与ST聚类分配之间有很强的对应性。接下来，生成了黑色素瘤MIA图谱。在这2个样品中，基质组织区隔主要由成纤维细胞和内皮细胞组成。在PDAC MIA图中也可以看到成纤维细胞和内皮细胞的共定位。在2个黑色素瘤MIA图中，还发现巨噬细胞相对于分布在黑色素瘤区域空间上受到限制：在黑色素瘤1 ST样品中，巨噬细胞被限制在黑色素瘤区域的外围，而在第二个ST样品中，巨噬细胞被限制在较大注释为黑色素瘤区域内的特定区域（黑色素瘤区域1）。在这2个转移性黑色素瘤样品中，还发现黑色素瘤区域的CD8+ T细胞明显耗竭，众所周知，CD8+ T细胞是用于预后和治疗反应的有用生物标志物。总之，这些结果证明了MIA图在生成关于细胞亚群与空间受限结构之间关系方面的实用性。

总结

作者提出了一种识别和空间定位异质性样本中不同细胞类型、亚群和细胞状态的方法：通过scRNAseq表征组织中存在的细胞类型和亚群，并同时通过ST鉴定转录组区域，而后利用这2种数据模式的系统性和无偏见性，使用称为MIA的方法来检测相关转录区域中的细胞群体富集。通过将MIA应用于10个PDAC ST样本，绘制了肿瘤微环境中不同细胞类型和亚群的空间位置，以及癌症亚区域内细胞类型之间的关系。鉴于scRNA-seq用于识别细胞状态和亚群的能力，MIA图谱提供的独特视角可帮助根据空间定位（相对于组织或其他细胞类型）为已识别的细胞状态和亚群分配潜在的功能性角色。对于不同肿瘤亚分类的确切组成可能因个体而异，该方法可以确定给定患者的亚群组成和空间定位，并且将来可能具有预后价值。

文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31932730

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