空间转录组样本制备二：BMK实验篇

      小编之前整理了空间转录组样本制备一：客户实验篇。接下来的工作就交给百迈客实验团队啦,今天特地推出空间转录组样本制备二：BMK实验篇，将会详细地把样本到公司后进行的一系列样本处理流程介绍一下，方便各位老师同学了解空间转录组技术完整的实验过程。

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上次说到样本经过异戊烷冻存和OCT包埋后进行保存和运输。当样本到达公司后，我们会首先取备份样本进行RNA提取，以确认样本状态（详细可参考空间转录组样本制备一），样本无误后便可开展后续的样本处理实验啦，具体的流程为：样本切片-放入芯片-甲醇固定-H&E染色-成像；当组织切片成像没有问题后再进行后续的文库构建：cDNA合成-cDNA扩增-打断&末修&加A-加接头-PCR扩增-QC&上机测序。

图1：BMK实验流程（图左是百迈客负责的样本处理流程，图右是样本制备完成后的文库构建流程）

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实验具体流程如下：

1.组织切片制备

首先我们进行组织切片，一般情况下切片的厚度会设置为10μm。然后将组织切片放到由10x Genomics提供的芯片上的捕获区域，接着用手指的温度对组织切片微加热从而将其粘到芯片上。由于捕获区域大小是固定的，过大的组织样本会跨过捕获区域，因此在切片的时候会对组织进行修剪，一般情况下组织截面的长宽不要超过8mm。

图2：组织切片制备流程 

FAQ: 可能许多老师会对切片的厚度有疑问，不同的组织切片厚度统一设置为10μm吗？

答案：不是的。我们会针对不同的样本设置不同的切片厚度，个别组织会设置为20μm（见图3），另外如果某些病例样本有特殊要求的话，可以由客户提前告知。

图3：组织切片推荐厚度表（上下滑动查看图片）

2.固定&成像

然后使用甲醇对组织切片进行固定，再使用H&E进行染色。之后使用明场成像观看组织切片的状态（见图4）。

图4 ：组织切片成像图

FAQ：可能有些老师要问，在做样本处理的时候，会有许多实验步骤，其中是否会有QC环节呢？

答案：有的。在做组织切片制备的时候，我们会同时制作多份切片样本，取其中的几份用作RNA提取和Agilent 2100检测，如果提取的RNA质量很好（见图5，5s峰低，28s/18s>2，RIN值>8），则认为组织切片质量非常好，可开展后续的实验。

图5：高质量RNA质检结果

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以上部分便是样本到达百迈客实验室后的样本处理流程，接下来再和各位老师同学们简单介绍一下后续的文库构建流程（图1右）。作为专业的测序实验团队，接下来的实验对我们来说更是轻松呢。

1.cDNA合成

首先我们将制备好的组织切片放到特定的加热装置上面，然后把装置放到PCR仪上面进行反应（见图6）。首先会先进行mRNA的捕获，然后反转录成cDNA，并合成二链cDNA。

图6：文库构建

2.测序接头连接

接下来先对合成的双链cDNA进行打断，以拿到适合测序长度的cDNA。然后对打断后的产物进行末端修复，并在3’端加A尾，再通过TA连接的方式加上测序接头。接着通过接头上的扩增区域进行PCR扩增，以富集测序文库。构建好的文库会进行QC，QC合格后将会在Illumina Nova平台进行测序。测序策略推荐PE150，产出250M reads即可。

      本期空间转录组实验篇主要讲了百迈客后续的样本处理及一些简单的文库构建等实验流程，希望能让老师同学们对空间转录组的样本制备和处理有一个宏观的认识，以方便大家准备各项实验。

参考文件《10x Genomics：Visium Spatial Protocols》