Cell | 10X 单细胞技术揭示慢性阻塞性肺病是一种干细胞病

摘要

慢性阻塞性肺病( COPD )是一种进展性的慢性支气管炎、小气道阻塞和肺气肿，该病也是世界范围内的主要死亡原因。虽然炎症、纤维化、粘液高分泌和化生上皮病变是本病的特征，但它们的起源和依赖关系仍不清楚。本文将单细胞克隆技术应用于慢性阻塞性肺病患者和非慢性阻塞性肺病患者的肺组织研究。相比于对照组，COPD 肺部被三种变异的干细胞所占据，这些变异的干细胞导致不同的变异性病变。当移植到免疫缺陷的小鼠身上时，这些变异克隆诱发了类似于慢性阻塞性肺病中的病理现象。值得注意的是，类似的变异体作为对照组和胎儿肺部的次要成分预先存在，可想而知在正常的免疫监视过程中起作用。然而，这些相同的变异体在扩大到较高的数量时，可能会驱动 COPD 的病理性和特征性的进展。

中文名称：慢性阻塞性肺病（COPD）再生化生性克隆促进炎症和纤维化

英文名称：Regenerative Metaplastic Clones in COPD Lung Drive Inflammation and Fibrosis 

期刊：Cell

影响因子：36.216

作者：Wa Xian 

发表时间：2020.4.15

单位：休斯顿大学生物与生化系干细胞中心

材料与方法

实验材料：

19 例 COPD 患者和 11 例健康对照、NSG 实验小鼠、HMVEC-L  细胞。

实验方法：

细胞体外培养、组织学和免疫染色实验、免疫缺陷小鼠的异种移植、流式细胞仪分析、转录组测序、单细胞转录组测序（10X）、全基因组外显子测序等。

实验结果

01

慢性阻塞性肺病中克隆细胞的异质性

对照组克隆库中随机抽取的 SPN-12 和 SPN-14 全基因组表达谱与之前的远端克隆细胞一致（图 1B 和 1C），然而COPD患者库中的 SPN-7 和 SPN-13 基因表达谱更为复杂。对 SPN-12、SPN-14、SPN-7 和 SPN-13 差异表达基因 PCA 分析聚类得到四个 clusters （图1B和1C）。尽管 COPD 患者存在克隆异质性，作者利用这些患者特异性克隆细胞库的再生特性，以及从它们中获得的单细胞衍生的克隆，来评估 COPD 和对照组上皮干细胞的特性。

图 1 COPD上皮细胞克隆异质性

02

COPD 克隆化生性

在体外分化来自 COPD 患者和对照组库的 cluster 1 克隆，产生了以 p63+ 基底细胞和基底上细胞为标志的正常上皮细胞（NM），表达 SCGB1A1、SFTPB 和 AQP4 的分化细胞与人类小气道和末梢细支气管上皮相似（图 2A）。Cluster 2 的克隆分化成以 p63+ 基底细胞和分化的小球细胞共同表达 SCGB1A1、MUC5AC 和 MUC5B 为标志的 GCM，而来自 cluster 3 和 4 的克隆则产生了以未成熟的 p63 细胞和分化的角蛋白10（Krt10）-和总蛋白（IVL）-表达的细胞为标志的 SCM（图 2A）。

将指定克隆的 100 万个细胞与 50% 的 Matrigel 混合后皮下注射，4 周后对所产生的异种移植结节进行检查（图 2B）。正常对照组克隆以及来自 COPD 患者的 cluster 1 克隆，在体内组装成一个由 p63、KRT5、SCGB1A1、AQP4、AQP4、AQP5、SFTPB 和 SFTPC 等阳性细胞组成的极化上皮细胞，就像正常人终末支气管或 cluster 1 克隆体外分化产生的细胞一样（图 2A、C 和 D）。与体外气液界面( ALI )培养结果相似，来自 COPD 库的 cluster 2 克隆的异种移植物形成了以表达 MUC5AC 和 MUC5B 的大型杯状细胞(图 2C 和 2D)为主的上皮细胞，而 cluster 3 和 4 克隆异种移植产生了表达 IVL 和 Krt10 的 SCM（图 2C 和 D）。这些克隆类型在异种移植中各自的分化命运在体外连续 250 天的繁殖中被证明是非常稳定的，这表明这些化生是高度稳定的、细胞自主的命运程序的结果（图 2E）。COPD 患者的 cluster 2、cluster 3 和 cluster 4 克隆的全外显子测序发现缺少大于 10Kb 的拷贝数变异事件（图 2F）。

图 2 变异型干细胞引起稳定的化生性病变

03

COPD 晚期以化生病变为主

COPD 患者晚期远端气道充满了与 p63+ 细胞包埋的正常上皮细胞一样的 GCM( MUC5AC+ )和 SCM( IVL+ )（图 3A）。定量分析发现 COPD 患者中 GCM 占 32.7%，正常人占 5.7%；COPD 患者中 SCM 占 26.8%，正常人不足 1%；COPD 患者中 iSCM 占 21.6%，正常人未检出到（图 2B）。作者通过免疫组化实验检测了健康对照和 COPD 4 期患者呼吸道上皮细胞与正常（ AQP5+ ）、iSCM( CXCL8+ )和 GCM( TRPC6+ )相关的 marker 基因（图 3C）。COPD 4 期患者末端肺部 CXCL8+ 含有 19.3%，正常人未检出；COPD 患者中 TRPC6 为 52%，正常人不足 2%（图 3D）。

图 3 COPD 化生和克隆中 p63+ 细胞

04

COPD 和对照克隆结构

三个 COPD 和三个对照组单细胞 RNA 测序，得到四个与 clusters1-4 类似的基因表达谱（图 3E）。COPD 以 clusters 2-4 为主，健康对照以 cluster 1 为主，scRNA-Seq 结果与 RNA-Seq 结果一致（图 3E）。

Cluster 1 细胞抗体 AQP5、cluster 4 细胞抗体 CXCL8 和 cluster 2 和 3 细胞抗体 TRPC6，对 19 例 COPD 患者和 11 例对照进行克隆变异定量（图 4A）。流式细胞分析结果与 scRNA-Seq 结果一致，变异体 clusters 2-4 在 COPD 患者占 77.7±5%，正常对照中占 12.2±6%（图 4B）。

图 4 异种移植组成和促炎反应

05

COPD 异种移植驱动中性粒细胞炎症

为了评估 COPD 上皮细胞的致病潜力，作者将 19 例 COPD 患者和 11 例对照组中的复合克隆库皮下移植到免疫缺陷小鼠中。4 周后，移植对照组小鼠组织学切片显示上皮囊肿并缺乏管腔细胞；移植 COPD 患者的小鼠上皮细胞囊肿并有大量的 CD45+/LY6G+ 白细胞浸润（图 4C 和 D）。中性粒细胞浸润程度的定量分析发现移植 COPD 为 36.4±14%，而移植对照组为 0.3±0.9%（图 4E）。

通过对四种克隆类型的基因表达谱的 pathway 富集分析发现，cluster 4 富集到多种炎症途径，包括抗原呈现、干扰素信号转导、移植物抗宿主反应和树突状细胞成熟（图 5A）。Clusters 1-4 趋化因子、白细胞介素和干扰素相关差异基因表达热图分析显示，cluster 4 与其他三个 cluster 差异显著，cluster 4 中整个干扰素-g pathway 相关基因高表达（图 5B）。

Cluster 4 克隆异种移植形成的结节表现出较强的白细胞浸润（图 5C）。Cluster 4 形成的上皮囊肿与其他三个不同，多种炎症介质蛋白高表达（图 5D）。Cluster 4 白细胞浸润 8 个月体外反应稳定（图 5E 和 F）。

图 5 COPD 克隆 cluster 4 构成高炎症

06

克隆变异会导致纤维化

COPD 异种移植中 77.1±7.2%  的上皮囊肿周围被 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体标记，而对照组较少（图 6 A-C）。Cluster 3 和 cluster 4 观察到类似的粘膜下肌纤维细胞的积累，而 cluster 1 和 2 未发现（图 6D）。Cluster 1-4 成纤维化相关基因差异表达热图分析显示 cluster 3 和 4 中多种促纤维化差异基因表达，cluster 1 中不明显（图 6E）。参与成纤维化调控的表达基因有 TGFb3、GDF15 和 TGFbR2，下游基因有 COL1A1 、MMP7、MMP13 和 BACH1（图 6F）。

图 6 cluster 3 和 4 驱动宿主肌成纤维细胞活化

07

正常和胎儿肺部存在的变异克隆类型

13 周和 17 周胎儿肺部克隆结构分析，13 周胎儿、3 名健康与 3 名 COPD 患者混合和亚型胎儿肺部 scRNA-Seq 分析发现少数变异克隆与 cluster2-4 类似，大部分与 cluster1 类似（图 7A 和 B）。通过体外和异种移植实验基因表达水平及最后驱动粘液分泌、纤维化和中性粒细胞炎症的潜能证实，胎儿与 COPD 克隆类似（图 7C 和 D）。这些变异克隆类型在正常成人和发育中的胎儿肺部均预先存在，这些变异在肺部中的正常功能以及 COPD 疾病发生发展过程中的机制尚不明确。

图 7 正常人和胎儿肺部变异克隆类型的鉴定

总结与亮点

COPD 患者肺部存在 GCM、SCM 和 iSCM 三种类型的克隆，这些克隆变异体会导致干细胞化生性病变，从而促进纤维化和炎症的发生；这些变异细胞及其分泌的因子可以成为该病的治疗靶点。

1、慢性阻塞性肺病的肺主要以三种致病的干细胞变异为主；

2、这些变异在表观遗传学上与 COPD 的化生病变有关；

3、变异主要驱动慢性阻塞性肺病的炎症、纤维化和气道阻塞等特征；

4、胎儿和正常人肺部类似的变异可能具有前哨功能。

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https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.047