百迈客推出的单细胞全长转录组，不是smartseq也不是Pacbio平台，而是10x Genomics和ONT平台的强强联合哦，而且推出了上门建库服务，且听小编慢慢道来~~
1、将10X单细胞技术与牛津纳米孔长片段测序技术完美结合3、告别单细胞3’端基因表达技术，直接获取每个细胞中的全长转录本
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百迈客作为Oxford Nanopore的战略合作伙伴，拥有丰富的MinION，GridION 和PromethION测序经验，是中国大陆首家通过 PromethION/GridION 双平台 DNA/RNA 样本Nanopore官方测序服务资质认证的公司。
全长转录组测序已被广泛应用于各种样本类型如血液、组织、细胞系。但将这项技术和高通量单细胞测序技术相结合是比较困难的，测序技术限制了对数千个单细胞转录组的高通量分析。单细胞3’端基因表达技术可以识别细胞亚型，但无法对这些细胞类型的全长mRNA亚型进行分析。在这里我们介绍两种方法，可以使用我们的长读长实时测序技术直接读取反转录的全长cDNA，并进行快速分析。这样能够有效的获取高质量的单个RNA分子的全部序列，准确辨别二代测序无法识别的同源异构体（isoform）、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本。研究人员使用微流控技术从样本中的单个细胞中扩增全长cDNA，每个单细胞极其产生的cDNA都进行了编码，以区分不同的细胞来源。然后将这些cDNA产物分成两组，一组用于illumina平台的短读长3 '测序，以检测基因表达量；另一组用于Oxford Nanopore长读长测序和全长转录本识别。在单细胞全长转录组测序中，长读长数据较难获得足够的深度来将细胞归类成不同的细胞类型，或者精确地定位到cDNA分子的细胞来源，所以短读长的数据仍然是必需的，可以用来辅助长度长数据的分析。
图1. 细胞Barcode和UMI分配策略示意图
研发人员发现，通过将纳米孔测序的高通量与UMIs引导的误差校正相结合，准确度与之前报道的10X genomics+PacBio的方法测序准确度相似,同时也比之前报道的仅用纳米孔测序的数据高10倍。这样，既可以对转录亚型进行准确的定义，又可以在单个细胞中识别序列的异质性。利用UMIs 进行单细胞纳米孔测序的方法将促进RNA剪接、编辑和印迹等生物进程的高通量单细胞研究。R2C2是一种不需要Illumina数据的前提下，仅用纳米孔测序数据分析单细胞全长转录组的方法。首先拿到 10X genomics的全长cDNA扩增产物，取10ng的cDNA，利用NEBuilder HIFI DNA Assembly Master Mix进行环化扩增，而非环化的DNA通过核酸外切酶I、III和Lambda进行消化去除。再利用Phi29进行滚圈扩增（图2），拿到大量的长链DNA，然后使用标准的ONT LSK-109建库试剂盒进行文库构建后上机测序。同时，研究人员也获取了Illumina数据以进行对比。在进行数据分析时，根据cell barcodes对这些数据进行分解，拆分到每个样本。R2C2技术中72%的数据可以成功分配到单个细胞，99.0%R2C2数据也出现在了Illumina平台的测序数据中，中位数序列准确度为96.4%。通过与之前10X genomics的纳米孔测序数据相比，R2C2测序数据似乎能够覆盖到整个转录本。
图2. R2C2实验流程示意图
研究人员使用Seurat分析包独立地对R2C2和Illumina两个技术的数据进行聚类，R2C2和Illumina的数据集均分为了三种类型的亚群，根据标记基因表达结果，细胞类型主要为T细胞(CD7)、B细胞(CD79A)和单核细胞(IL1B) ,与预期的PBMC样品组成一致（图3）。更重要的是，两种方法中99.5%的数据来自于同样的细胞，表现出较好的一致性。
图3. R2C2和Illumina数据细胞聚类示意图R2C2使用串联体测序的理念来提高ONT reads的准确性，从92%提高到约98%，同时每个小离子流细胞仍然可以产生超过200万个全长cDNA序列，使用这些单细胞数据可以用来确定细胞亚群，研究细胞多样性。这项技术开创了一种新的、简单的、强大的方法——使用单一的测序方法（不像其它方法需要结合不同测序平台的数据）——可以从成千上万的单个细胞中提取出大量信息。
参考文献：
1. bioRxiv preprint first posted online Nov. 5, 2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/831495.
2. bioRxiv preprint first posted online Jan. 11, 2020; doi: http://dx.doi.org/10.1101/2020.01.10.902361.