单细胞测序-解析阿尔兹海默症文章解读

参考文献：Shun-Fat Lau, Han Cao, Amy K. Y. Fu, et al. Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer’s disease.
发表杂志：PNAS
IF：9.41

研究背景

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease：AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。全球大约有2400万人患病，并且以每20年翻一倍的速度快速增长。其病理特征包括淀粉样蛋白前体蛋白沉积、神经元纤维缠结和神经炎症等。但由于其发病机制在分子水平上没有深入了解，包括突触功能受损、血脑屏障保护丧失等，导致没有有效的医疗手段来治疗AD患者。

研究目的

探索AD患者中未知的分子变化以及可能导致AD中内皮细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞功能失调的潜在细胞靶点。

研究对象

12个AD患者；9个NC患者；

研究方法

A：对21个样品进行单细胞测序，筛选潜在靶点。
B：利用芯片数据对结果进行验证。

研究结果

1. 单细胞测序

对21个样品进行单细胞测序，在AD和NC的大脑样本中共获得169,496个细胞（其中AD：90,713；NC：78,783），通过UMAP聚类分析，共获得43个独特的细胞簇，作者根据他们各自的转录组谱和和之前报道的细胞类型markers将其最后分成6种主要细胞类型：星形胶质细胞、内皮细胞、兴奋性神经元、抑制性神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。通过筛选6种细胞的独特的特征基因，揭示了病变和健康脑组织中细胞类型的异质性。

进一步分析中，比较AD和NC大脑样本中不同细胞类型的比例，UMAP聚类分析显示，AD和NC样本的星形胶质细胞、兴奋性神经元、抑制性神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞的比例相似，但AD组内皮细胞比例高于NC组（3.0 ± 0.9% vs. 1.2 ± 0.3%）。

在AD和NC大脑样本中，共鉴定出2,190个差异表达基因，其中551个在星形胶质细胞中，299个在内皮细胞中，347个在兴奋性神经元中，125个在抑制性神经元中，340在小胶质细胞中，528个在少突胶质细胞中。在这些基因中，有11个在所有类型细胞中差异表达，从此也表明大部分观察到的与AD相关的转录组改变是细胞类型特异性的。

通过对差异基因的功能分析，兴奋性和抑制性神经元（例如SNAP25）中的DEGs都与突触相关；星形胶质细胞中下调的基因（如HES5，NTPK2，SLC1A2，SPARCL1和WIF1）与突触信号和谷氨酸分泌相关；AD样本中调节兴奋性突触发生的星形轴突蛋白基因（如NRXN1和NRXN3）表达下调；除此之外，小胶质细胞（AIF1、CD14等）、内皮细胞（CLDN5、EPHA4）、少突胶质细胞（CTNNA2、OPALLN）参与免疫应答、血管生成和髓鞘形成等过程的基因都出现表达失调。

综合上述结果表明，AD的细胞类型特异性转录组改变与4种分子途径有关：
a) 内皮细胞的血管生成
b) 内皮细胞和小胶质细胞的免疫反应
c) 少突胶质细胞的髓鞘化
d) 星形胶质细胞和神经元的突触信号传导。

2．芯片数据验证

利用来自前额叶皮层样本数据（AD：n=310；NC：n=157）和颞叶皮质样本（AD：n=106；NC：n=135）进行比较分析，在我们单细胞鉴定出的差异基因中，分别检测到1,113和764个显著差异表达（P<0.05）。此外，在前额皮质数据中，86.7%的差异基因表达水平一致。

3．亚群分析

通过对AD和NC样本中个体细胞类型的亚群异质性研究，通过亚聚类分析，在星形胶质细胞的亚聚类分析中鉴定出9个转录组上独特的亚群。AD和NC样本中，亚群a2,a4,a5,a8和a9的相对比例类似，而与NC样本相比，AD样品的a1和a6比例分别大了9.9%和10.2%，a3的相对比例小23.5%。

a3亚群的转录特征与神经递质代谢相关的基因有关，包括SLC1A2和GLUL。a1和a6亚群表现出丰富的压力影响基因的表达，例如CRYAB（热休克蛋白）、GFAP（反应性星形胶质细胞marker）、LINGO1（髓鞘形成的负调控）。此外，HMGB1（传递损伤信号给周围细胞的警示基因）在a1和a6中显著高表达。

在少突胶质细胞的亚群分析中，亚聚类分析共获得9个亚群。其中o1和o2差异表达上调，o3和o5差异表达上调；通路功能分析显示，下调的少突细胞亚群与髓鞘形成的相关，包括MOBP和OPALIN。而上调亚群的转录特征包括HSPA1A、NEAT1和PDE1A的表达丰富，这种表达模式类似于多发性硬化患者的少突胶质细胞。因此在AD患者中，成熟的有髓少突胶质细胞数据减少，而再生的少突胶质细胞数量增加。

在小胶质细胞亚群分析中，共获得13个亚群，通过分析表明典型小胶质细胞亚群的缺失可能导致AD中补体信号的不平衡和突触剪枝。

在内皮细胞亚聚类分析中，共获得7个亚群。其中三个被分为上调亚群（e1，e3和e4）。转录组分析显示，与血管生成相关的基因（CLDN5、ERG、FLT1和VWF）在这三个亚群中显著富集。通路分析和蛋白互作用网络分析进一步表明这些基因形成一个互作网络并参与6种主要的生物学过程：血管生成/粘附、跨膜运输、金属离子体内平衡、细胞呼吸、rRNA处理等。

研究结论

通过单细胞测序，比较AD和NC不同样本细胞的异质性，共确定了4个主要分子途径：
a) 在星形胶质细胞和神经元细胞中突触信号受损
b) 少突胶质细胞中髓鞘形成减少
c) 小胶质细胞和内皮细胞中异常的免疫激活
d) 增强内皮细胞血管生成

总之，单细胞测序突出了AD患者内皮细胞中血管生成异常的潜在作用；星形胶质细胞的异常调控可能导致AD的突触损伤；同时，我们的研究为AD患者内皮血管生成与血脑屏障异常之间的潜在联系提供了证据；

这项研究确定了内皮细胞和神经细胞特异性分子靶点，可用于神经稳态的治疗恢复和改善阿尔兹海默症的病理进展贡献部分力量。

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