Science Advances | 使用空间转录组构建小鼠的大脑图谱

英文题目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文题目：成年小鼠脑分子图谱

发表时间：2020-06-26

发表杂志：Science Advances

影响因子：13.116

DOI：10.1126/sciadv.abb3446

脑图对于整合信息以及解释电路与行为的结构-功能关系至关重要。本文旨在纯粹通过使用全脑空间转录组学基于对空间定义特征的无偏识别来生成成年小鼠大脑的系统分类。研究发现分子信息足以推断大脑的复杂而详细的神经解剖组织结构。无监督（非专家，数据驱动）分类显示了特定于区域和层的子区域，例如在等皮层和海马体以及纹状体的新亚区。分子图谱进一步支持了从单细胞RNA图谱中表征神经元的空间特性，并提供了使用最小基因集（大脑调色板）为大脑添加注释的资源。总之，本研究建立了一个分子图谱来正式定义大脑区域的空间组织，包括用于映射和靶向离散神经解剖结构域的分子代码。

研究背景

在建立子区域及其边界的参考图以及确定神经元类型及其连接性的多样性方面，对成年大脑进行映射是探索定义动物行为多样性的脑回路的结构与功能关系的核心。在过去的一个世纪中，生成脑图谱的主要原则是使用显微镜对组织标志物的注释。空间定义在很大程度上依赖于细胞结构特征，例如细胞密度和形式的差异，以及源自关键分子（例如神经递质）分布的化学结构定义。现在，该领域开始揭示微观和中尺度水平与人脑中基因表达的神经元和区域连接的细节。这些组织定义和由此产生的小鼠大脑图谱对于建立探索大脑结构和功能关系的实验框架至关重要。

实验神经科学依赖于重复准确地记录和操纵特定大脑区域中神经元亚型活动的能力，因此，基因靶向方法已被证明在针对细胞类型的靶向中极为有价值。空间分类主要限于等皮质中的层特定基因表达模式，没有捕获空间分隔区域的巨大多样性，例如等皮质中的前后（AP）和中外侧（ML）特化等等。海马体和其他皮质下区域的复杂三维组织。只有少数大脑区域已普遍接受边界定义，这提高了空间定义从分子模式描述神经系统组织的重要性。我们已经在成年小鼠的大脑上应用了空间转录组学（ST），基于组织基因表达分类来生成详细的解剖学定义而建立了分子脑图谱。

实验方法详解

1、脑切片

选取三只雄性小鼠（9周龄）的大脑浸入冰冷的人工脑脊液中，然后将多余液体吸干，沿矢状中线将半球分开，使用OCT包埋左半球，并在干冰上冷冻。将组织切成10μm的切片（-12℃）。 

2、固定，染色和成像

将切片固定在甲醛中，之后在PBS中洗涤，用异丙醇处理1分钟后风干。HE染色干燥后，将载玻片用85％甘油固定，扫描拍摄切片图像。 

3、组织预透化和透化

为了使组织预先通透，将小鼠脑的切片与胶原酶一起在平衡盐溶液（HBSS）缓冲液中与牛血清白蛋白（0.2μg）混合，在37°C下孵育20分钟。在0.1×盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液中洗涤后，将切片在37℃下用0.1％胃蛋白酶/ HCl透化6分钟。然后，用0.1×SSC缓冲液洗涤。

4、反转录和文库制备

透化后，将含有逆转录酶的混合物添加到每个切片中， 42°C孵育过夜。接下来，为了从载玻片上去除组织，将切片与蛋白酶K消化（PKD）缓冲液在56°C孵育1小时。然后用USER酶从载玻片上切下带有结合的cDNA的表面探针。从每个孔中收集释放的探针，并转移到单独的试管中。接下来，使用自动化MBS 8000系统进行第二链合成，cDNA纯化，体外转录，纯化，接头连接，连接后纯化，第二链合成和纯化。使用Illumina索引引物通过PCR扩增cDNA，并在自动化MBS系统上使用磁珠纯化。使用安捷伦生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒分析最终文库的大小分布。用Qubit dsDNA HS测量文库的浓度。在Illumina NextSeq平台上对文库进行测序。在第一个阅读序列中对30个碱基进行测序，以确定空间条形码和UMI；在第二个阅读序列中对55个碱基进行测序，以覆盖遗传区域。

5、ST阵列斑点的染色和图像对齐

通过与含有标记的寡核苷酸的杂交混合物孵育来检测ST点。使用与明视场图像相同的显微镜获取荧光图像。

6、图像对齐和斑点检测

H＆E染色部分的图像和荧光图像（Cy3，斑点）通过采样后叠加图像进行对齐。用亮度和对比度滤镜将两个图像中可见的常见组织特征进行对齐。将对齐的图像裁剪到阵列的边界，在组织区域外部的Cy3图像周围创建一个遮罩，然后保存图像用ImageJ进行斑点检测,使用分析粒子特征检测斑点质心。检测到的斑点质心（内部组织）像素坐标已导出到文件。使用R脚本将像素坐标转换为数组坐标，并通过舍入方法将其分配给数组位置。

研究结果

一、全脑空间转录组结果

通过使用ST捕获成年小鼠大脑中基因表达的空间模式，生成了全脑分子图谱。将来自一个大脑半球的75个冠状切片（覆盖整个AP轴）杂交到ST阵列上。使用旨在生成参考图的计算框架，作者将每个成像的大脑半球部分（包括组织中ST点的位置）与Allen小鼠大脑参考图集（ABA）对齐（图1B）。这样就建立了完整的大脑图集，其中包含有关组织坐标。参考ABA神经解剖学定义和空间定义的基因表达模式的信息（图1C），每个点平均检测到4422个基因和11,210个读数（4422±1164个独特基因，11,210±5943个读数）。经过QC的完整数据集包含34,053个斑点的15326个独特基因表达的信息（图1 D&E）。作为已建立的区域和细胞标记物的空间表达模式，我们将等皮层标记物Rasgrf2，纹状体标记物Gpr88和丘脑标记物Rora在2D和3D中的表达可视化，并将其与ABA原位杂交（ISH）信号（图1F）。ISH模式与分子图谱中基因表达之间的对应关系使得支持使用图谱中的完整分子信息提取空间基因表达和解剖学定义模式成为可能，而无

需引入任何先前的空间边界或区域知识。

图1 | 使用空间转录组绘制全脑分子图谱

二、从分子图谱中提取新空间域的计算方法

为了生成基于分子模式的成年小鼠大脑的空间分类，执行降维和聚类分析了ST基因表达数据。通过应用独立的成分分析，使用了前50％的可变基因进行了降维。

用分类颜色方案对斑点进行了可视化处理（图2B），并应用RGB（红色，绿色，蓝色）配色方案，进一步可视化了簇之间的分子关系。基于此颜色方案的绘图显示了整个大脑中分子相似簇的分布（图2 C-E）。通过改用神经解剖学相关的颜色代码（ABA参考配色方案）基于图像集中它们的已知位置来标注斑点，我们揭示了分子分类（纯粹来自基因表达）与空间之间的关系（图2F）。为了进一步映射聚类之间的关系，使用了层次聚类来生成分子聚类的树状图。然后根据扇形图中的两个定义对每个分子簇进行颜色编码：基于3D t-SNE RGB颜色代码的簇的分子相似性，以及表示神经解剖结构同一性的颜色代码（ABA参考颜色代码；图2G）。从这些可视化中可以得出结论，分子聚类在大脑区域内遵循空间模式，并与当前神经解剖学定义的某些方面保持一致。

接下来，应用SVM算法将各个点和相应的分子簇转换为连续的3D体积，形成一张全脑图集，以进行解剖和空间解析（图2H），其中包含分子簇的空间组织的详细信息（图2I）。分子图谱可用于群集和基因表达的交互可视化，3D分子图谱进一步支持以任意角度（例如水平和矢状）对大脑进行虚拟切片，以轻松可视化分子簇及其边界的空间范围。

为了探索分子图谱作为精细规模的新空间分类路线图的潜力，并将分子图谱的结果与可用的参考图谱进行比较，我们首先关注等皮质的空间组织。作者使用了等皮质的神经解剖学定义和ABA参考的命名法，注释了55个属于等皮质的分子簇。

图2 | 从分子图谱中提取新空间域的计算方法

基于等皮层的基因表达特征（图3A），在t-SNE图中对等皮层簇的可视化显示了潜在的分子-空间结构。等皮层簇根据它们的层特征显示出明显的分离，位置和Marker表达概述了一些已建立的层划分（图3BCD）。同时作者发现分子聚类还揭示了等皮层的全区域化，即AP和ML维度上的分离（图3E）。例如，分子团簇被清晰地分离成明显的额皮质亚区(PL, ACA和ORB), 形成初级和二级躯体运动皮层和躯体感觉皮层之间的边界(MOp, MOs, SSp以及 SSs)，并且描述了后皮质的空间轮廓（图3F-I）。在分子图谱中，STRd和其他纹状体区域可以直观地在t-SNE图中显示为17个离散的簇，这些分子簇反映了空间信息，如ABA参考色标所示(图3,J和K)。这些分子簇建立了一个新的分类纹状体到空间受限亚区,包括离散Marker的表达(图3,L和M)。可视化纹状体集群的2D和3D支持背侧纹状体的空间组织，除了腹侧和中隔的分裂外，还在AP轴和ML轴上形成了离散的分子结构域(图3N&O)。

总的来说，捕获成年小鼠大脑的空间基因表达特征，可以让我们能够仅从分子信息就可以构建详细的全脑图谱，进而建立神经解剖学空间定义的正式系统。

图3 | 同形皮层和纹状体的亚区域和图层的新分子定义

三、使用分子图谱绘制单细胞的空间原点

基于单细胞RNA测序的神经元分子谱分析已被用于建立神经元亚型分类的分子代码。

这种分类方案通常缺乏被分类神经元的空间来源信息。作者研究了分子图谱是否可以根据单个神经元细胞RNA测序分子图谱作为一种资源绘制它们的空间起源，从而为大规模细胞分类提供了细胞类型空间维度的定义。为提供空间映射方法的原理证明，作者使用了过往研究中23822个神经元和非神经元细胞的单细胞RNA测序数据，这些细胞来源于初级视觉皮层(VISp)与额叶皮层[前外侧运动皮层(ALM)]。

作者设计了一个带有分子图谱的神经网络分类器来预测每个单细胞的空间起源，并量化了ALM和VISp分子簇的空间映射（图4A&B）。在预测概率时使用一个阈值来选择50%对空间映射置信最高的神经元（可能性99%），发现76%的谷氨酸神经元被准确地分类到正确的区域(VISp和ALM, 65%没有阈值设定)，37%的被分配至正确的区域和层（图4 C&D）。相反，作者发现GABAergic神经元以及大多数非神经元细胞簇，包含有限的空间来源信息，不能准确地映射到分子图谱上(图4 E)。总之，这证明了分子图谱作为利用单细胞分子信息绘制神经元空间起源的资源价值。

图4 | 使用分子图谱绘制单细胞的空间原点

四、一个减少的大脑基因索引捕获了整个大脑的组织

作者尝试确定一个足以捕获全局的大脑区域细分的小基因集。完整的分子图谱是基于7663个基因的表达模式。为了用无偏方法建立能捕捉全局空间信号的基因，作者从ICs或SVM模型中选择，并使用标准化交互信息索引(NMI)作为聚类相似性的度量（图5A）。在NMI 0.6的基础上，建立了一个由266个独特基因组成的panel，利用ICs中的基因进行聚类。研究发现这266个基因建立的索引表，在使用时可将大脑定义为181个分子簇，建立了与完整分子图谱中发现的聚类组织类似的全脑空间划分（图5 B-D）。作者计算了分子图谱和简化版之间的聚类相似性，以可视化空间保守反映亚区域之间的成对相关性（图5E）。且发现分子区域的空间定义是全局保守的（图5F），如在由几个等皮层、海马后区和嗅觉区亚区域组成的簇群中（图5G），以及主要的海马区簇群（图5H）等。因此，从这个分析得出结论，使用266个基因，即使某些区域需要更丰富的基因进行分类，在全脑尺度上大多数亚区域也可以在空间上定义。

图5 | 减少的大脑基因索引捕获整个大脑的空间组织

总结

作者基于全脑范围内ST模式的无监督分类建立了成年小鼠大脑的分子图谱。这种方法是一个在全脑范围内映射离散空间域的无偏方法，并且还利用空间信息开发分子方法以研究神经系统组织，引入了分子和空间代码进化保守性的能力，以及它们与生理学和病理学的关系。另外作者简化了大脑基因索引测试区域分类的能力，这些基因也足以将整个成年大脑映射到相关的子区域。

这种方法从分子视角对全脑进行分类绘制图谱，并比较物种间脑区域分布的保守分子标记，可作为关键点为治疗脑部疾病提供新策略。

文：阿强

排版：市场部

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