利用Seurat处理空间转录组数据

空间转录组能够从组织切片样本中获取包括空间信息在内的全部转录组数据，从而获得功能基因在特定组织区域内的表达情况。这将有助于科学家更好地理解疾病和生物学过程。

Seurat官方也提供了相关的处理流程，帮助使用与学习。

数据获取

seurat官方教程中的数据使用的是10x官方提供的小鼠脑组织数据。

https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.1.0/V1_Mouse_Brain_Sagittal_Anterior

下载对应的h5结果和spatial结果

ps:建议放在同一个文件夹下

data
|-- spatial
|-- filtered_feature_bc_matrix.h5

也可以下载原始数据自己进行处理。

原始数据处理

对于10X空间转录组数据而言，可以使用官方软件space ranger对原始数据进行处理。

sapce ranger主要的功能：

spaceranger mkfastq ##将bcl数据转换成fastq数据
spaceranger count  ##将fastq数据转换成空间特征矩阵
spaceranger aggr ##可以将同分组，同流程的样本进行合并

处理思路大致如下：

space ranger结果包含许多结果：

├── analysis
├---├── clustering
│---├── diffexp
│---├── pca
│---├── tsne
│---└── umap
├── cloupe.cloupe
├── filtered_feature_bc_matrix   ##需要的表达矩阵结果
│---├── barcodes.tsv.gz
│---├── features.tsv.gz
│---└── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5  ##需要的表达矩阵结果
├── metrics_summary.csv
├── molecule_info.h5
├── possorted_genome_bam.bam
├── possorted_genome_bam.bam.bai
├── raw_feature_bc_matrix
│---├── barcodes.tsv.gz
│---├── features.tsv.gz
│---└── matrix.mtx.gz
├── raw_feature_bc_matrix.h5
├── spatial  # 空间信息
│---├── aligned_fiducials.jpg
│---├── detected_tissue_image.jpg
│---├── scalefactors_json.json
│---├── tissue_hires_image.png
│---├── tissue_lowres_image.png
│---└── tissue_positions_list.csv
└── web_summary.html

一般需要的是 filtered_feature_bc_matrix/filtered_feature_bc_matrix.h5结果，和对应的spatial空间信息文件。

接下来利用Seurat流程进行分析。

数据读取

利用Seurat包中的Load10X_Spatial函数进行读取。

##加载相关R包
library(Seurat)
library(patchwork)
library(tidyverse)
###数据读取
brain<-Seurat::Load10X_Spatial("data/")
ps:如果不设置filename参数的话，默认读取"filtered_feature_bc_matrix.h5" 文件

数据预处理

###数据在切片上的整体基因表达情况

plot1 <- VlnPlot(brain, features = "nCount_Spatial", pt.size = 0.1) + NoLegend()
plot2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "nCount_Spatial") + theme(legend.position = "right")
wrap_plots(plot1, plot2)

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需要对数据进行标准化处理，从而减少测序深度带来的影响。同时，因为组织中细胞的密度差异原因，使得数据存在异质性，所以需要进行有效Normalization，但是因为组织特异性的原因，常规的标准化方法（LogNormalize）不适用。

Seurat推荐使用SCTransform()进行标准化处理

###对数据进行标准化处理

brain <- SCTransform(brain, assay = "Spatial", verbose = FALSE)


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基因表达的可视化

可以使用Seurat中的SpatialFeaturePlot函数来查看组织上的相关基因的表达情况

SpatialFeaturePlot(brain, features = c("Hpca", "Ttr"))

##未SCT标准化之前

##SCT标准化之后

##相关参数设置

pt.size.factor - 这将缩放spot的大小。默认是1.6
alpha - 最小和最大透明度。默认是c(0.1,1)

#相关参数修改

p1 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "Ttr", pt.size.factor = 1)
p2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "Ttr", alpha = c(0.1, 1))
p1 + p2


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降维、聚类、可视化

使用与scRNA-seq分析相同的工作流程，对空间转录组数据进行聚类。使用基于图形方法进行聚类。

brain <- RunPCA(brain, assay = "SCT", verbose = FALSE)
brain <- FindNeighbors(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)
brain <- FindClusters(brain, verbose = FALSE)
brain <- RunUMAP(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)(向左滑动查看更多)
使用DimPlot函数或SpatialDimPlot函数对cluster进行展示和查看。

####可视化查看

p1 <- DimPlot(brain, reduction = "umap", label = TRUE)
p2 <- SpatialDimPlot(brain, label = TRUE, label.size = 3)
p1 + p2


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##查看特定类的情况

SpatialDimPlot(brain, cells.highlight = CellsByIdentities(object = brain, idents = c(2, 1, 4, 3, 5, 8)), facet.highlight = TRUE, ncol = 3)

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识别空间变量特征

第一种是基于组织内预先注释的解剖区域来进行差异表达，这可以通过非监督聚类或先验知识来确定。

##识别两个cluster中的差异基因

de_markers <- FindMarkers(brain, ident.1 = 4, ident.2 = 6)
SpatialFeaturePlot(object = brain, features = rownames(de_markers)[1:3], alpha = c(0.1, 1), ncol = 3)(向左滑动查看更多)

另一种方法是在没有预先注释的情况下，寻找显示空间模式的特征。利用FindSpatiallyVariables函数进行实现。

brain <- FindSpatiallyVariableFeatures(brain, assay = "SCT", features = VariableFeatures(brain)[1:1000], selection.method = "markvariogram")


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###查看显著的基因

top.features <- head(SpatiallyVariableFeatures(brain, selection.method = "markvariogram"), 6)
SpatialFeaturePlot(brain, features = top.features, ncol = 3, alpha = c(0.1, 1))


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暂时先介绍到这，如果有兴趣可以直接查看原文。https://satijalab.org/seurat/v3.2/spatial_vignette.html

文：Peer

排版：市场部

参考资料：

Analysis, visualization, and integration of spatial datasets with Seurat

Seurat 新版教程：分析空间转录组数据

ST Pipeline: an automated pipeline for spatial mapping of unique transcripts

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