来了-单细胞免疫组库升级版v2.0

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单细胞免疫组库测序技术

自2015年问世以来，一直被人们火热关注，那么免疫组库到底是何方神圣，竟惹无数大咖聚焦于单细胞免疫组库研究呢？单细胞的免疫组库又该如何研究呢？免疫组库都分析了啥？小朋友是不是有很多问号呢？小编也是如此，今天小编就给大家聊聊单细胞免疫组库那些事，看看各位大牛都在研究啥。

01什么是免疫组库

淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布广泛。T淋巴细胞（T cell）和B淋巴细胞（B cell）主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于T细胞受体（T cell recptor, TCR）和B细胞受体（B cell recptor, BCR），这两类细胞表面分子的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子，而免疫组库就是针对B/T淋巴细胞抗原受体多样性检测，即BCR/TCR的多样性。BCR和TCR一般由可变区(V区)、多变区(D区)、连接区(J区)、恒定区(C区)构成, V(D)J区域在遗传过程中发生重排或重组，形成大量不同的组合形式，导致BCR和TCR基因序列多样性极其丰富，这些序列多样性集合称为免疫组库。

图1.免疫组库V(D)J多样性

02 TCR/BCR多样性

免疫组库TCR/BCR多样性是如何产生的呢？一般人免疫细胞可以产生上万个抗体应对抗原的刺激发生免疫反应，那这上万个抗体是不是有对应上万个基因编码的呢？不是，这些抗体都是由TCR和BCR编码的，为何TCR/BCR能够编码如此之多的抗体，这里我们就不得不聊聊TCR和BCR的特殊结构，正是基因结构决定了基因的功能。上面也提到了一般TCR和BCR都是不同的V(D)J基因片段组成，其中BCR是由两条重链（IgH）和两条轻链(Igκ，Igλ)组成，重链包含了一个可变区（VH）和3个恒定区（CH1/CH2/CH3），轻链则包含了一个可变区（VL）和一个恒定区（CL）；而TCR由两种肽链组成，αβ链/γδ链，相应的编码基因TCRA,TCRB,TCRG,TCRD，同时TCR与一种跨膜蛋白复合物CD3结合，由CD3介导胞内信号转导，一般外周血中TCRαβ 表达的T细胞占据了95%~99% ；TCRγδ表达的T 细胞只有1%~5% 。TCR和BCR的可变区（V）分为CDR区和FR区；CDR区有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR/BCR的抗原结合特异性。

图2. BCR &TCR结构示意图

淋巴细胞抗原受体多样性的产生归根到底还是胚系基因的重组和重排，即BCR的重链（IgH）和轻链（Igκ，Igλ）和TCR的α链和β链。TCR和BCR的特点：1）人体受体链编码基因分属不同染色体上不同的基因座位；2）胚系结构由相互分离、不连续的DNA片段V(D) J构成，且多数V(D) J区由多个片段组成；3）在DNA水平，V(D) J基因不同区段会相互重组，形成可编码的Ig/TCR基因，构成淋巴细胞受体结构的多样性。

图3. BCR &TCR重排原理

03免疫组库的主要特征

（1）TCR/BCR序列组合有多少？

既然TCR/BCR V(D) J区域基因可以发生重排，那么这种重排最终可以形成多少组合呢？理论上来讲，重排的过程是随机发生，根据不同链V区、D区、J区片段的个数排列组合可以达到10¹²以上的序列组合。其次，T/B细胞在成熟分化的过程中还会发生一些体细胞突变，连接位点核苷酸插入缺失等，这就又增加了TCR/BCR的多样性，所以总的来说TCR和BCR序列理论上可以达到10¹²~10¹⁸ 。

表1. TCR/BCR序列组合多样性

（2）免疫组库细胞类型特征

免疫组库是针对T细胞和B细胞受体多样性的检测，那么免疫组库细胞类型是不是只有这两类呢？不是，这里免疫组库细胞类型更具体指的是B细胞和T细胞表达链，是 TCRα chain or “TRA,” 还是 TCRβ chain or “TRB”的细胞，或者BCR的重链（IgH）和轻链（Igκ，Igλ），这样精确的表示有助于分析免疫组库细胞的克隆型。

图4. 免疫组库细胞类型

（3）克隆型占比

分析可得成对克隆型的完整V(D)J基因组、链的CDR3克隆型以及每个克隆型的计数和相对频率，寻找优势克隆，挖掘疾病机理。

图5. 免疫组库前10克隆型占比

（4）克隆型序列特征注释

分析比对BCR的重链和轻链的匹配信息，得到免疫球蛋白亚型，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的注释；比对TCR数据可得到α链和β链的匹配信息；以及CDR3区核酸序列、氨基酸序列、CDR3序列长度分布、 V/J基因频率分布等。

图6. 克隆型序列特征注释

（5）免疫组库克隆型细胞分群

将5’表达和免疫组库数据进行联合分析，基于基因表达分群的基础上，进一步用克隆信息创建新的细胞亚群，精准定位免疫克隆型的差异分布，锁定靶向研究细胞亚群。 

图7. 免疫组库克隆型细胞分群

04免疫组库应用领域

免疫组库不仅可以了解TCR/BCR克隆型，还可以联合转录组数据深入挖掘生命机理，为免疫组学研究提供更高效的平台，在肿瘤微环境、感染性疾病、自身免疫疾病等研究领域有着广泛的应用前景。

表2. 免疫组库应用领域

05 免疫组库如何检测？

传统免疫组库研究存在很多局限性，其建库基于对TCR/BCR特征序列的捕获，只能使用多重PCR、5’RACE来研究CDR3区域，无法获得V(D)J基因全长序列、重链轻链/αβ链配对信息、T/B细胞克隆之间的关系、受体与特定抗原之间的对应关系等。此外，传统免疫组库研究基于细胞群体，单个或少量细胞研究往往受限。自2015年10x Genomics 平台的推出，大大加快了免疫组库研究领域的应用，同时实现了单细胞水平的高分辨，解决传统方法的局限性，降低了单细胞免疫组库研究的门槛。

表3. 免疫组库检测方法比较

技术特点：

• 揭示克隆性、多样性、抗原特异性和细胞环境

• 组装并注释全长V(D)J基因序列

• 从单个T细胞识别α和β链序列

• 将来自单个B细胞的重链和轻链免疫球蛋白(Ig)序列以全同型分辨率配对

• 同时测定同一细胞中TCR、B细胞Ig表达及5’基因表达

表8. 10x Genomics 平台

06 百迈客单细胞免疫组库技术

1. 国内首推单细胞免疫组库v2.0服务

针对免疫组库的研究现状，百迈客隆重推出单细胞免疫组库升级版v2.0测序服务，该技术是通过10x Genomics基于微流控和油滴包裹技术的Chromium单细胞系统平台，在单细胞水平同时检测转录组基因表达和TCR/BCR多样性。不仅如此，百迈客推出的单细胞免疫组库升级版v2.0，使用chipK芯片和dual index，全新体验，性能更优，将全面突破以往免疫组库检测技术的局限，为单细胞免疫组库研究带来新的技术应用。

 图9. 单细胞免疫组库 V2.0 vs V1.1

2. 实验原理

利用10x Genomics平台完成单细胞的捕获、分离、单细胞悬液GEM制备，5’反转录，全长cDNA扩增，构建5’基因表达文库、TCR的V(D)J文库或和BCR的V(D)J文库，进行后续数据分析。

图10. 百迈客单细胞免疫组库测序技术原理

3. 单细胞免疫组库v2.0 建库流程

百迈客全新推出的单细胞免疫组库升级版2.0，采用双端index(dual index, i5 & i7),明显降低了错配率，改善了TCR/BCR多样性的精确性，使得TCR/BCR链对能够精准匹配（α&β链，重链&轻链），全面获取单细胞免疫组库的多样性以及其特征。

图11. 单细胞免疫组库测序建库过程

4. 全面的单细胞测序服务平台

百迈客是国内首批引进10x Genomics单细胞测序平台，同时具有10x 单细胞转录组、单细胞全长转录组、空间转录组、单细胞免疫组库测序，实现10x单细胞平台全面优质服务。

图12. 百迈客全面的单细胞测序服务平台

  百迈客是国内首批引进10x Genomics单细胞测序平台，使用Chromium系统采用先进的微流控、油滴包裹和barcode标记等技术实现一次性分离、高效标记捕获；同时具有10x 单细胞转录组、空间转录组、单细胞免疫组库、全长转录组测序，实现10x平台全面优质服务；已经具有大量单细胞分离捕获，极低量RNA反转录扩增建库成功经验；提供单细胞分离捕获、反转录建库、测序、标准分析和高级分析全套单细胞转录组测序服务；强大的生信团队不仅提供基本分析，还提供细胞分化轨迹分析等多种高级分析；资深单细胞技术人员为您提供专业的课题方案设计，为您量身订造专属个性化分析。百迈客医学科研服务事业部，是您值得信任和托付的团队，我们将竭诚为您服务，期待与各位老师在今后的日子携手合作，相信百迈客出品，必是精品。

文：驷说

排版：市场部

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