文献分享 | Nano Letters | 通过激光刺激分子靶向的纳米颗粒对血脑屏障进行可逆调节

今天分享一篇2021年9月份发表在 Nano Letters 上的文章，该文的通讯作者是德克萨斯大学达拉斯分校秦真鹏教授和德克萨斯大学西南医学中心Robert Bachoo教授。秦真鹏教授的研究领域是生物运输和纳米技术；Robert Bachoo教授的研究兴趣主要是血脑屏障破坏、脑肿瘤代谢、恶性转化、干细胞生物学、肿瘤细胞迁移、肿瘤微环境等。文章的第一作者是德克萨斯大学达拉斯分校Xiaoqing Li和Qi Cai，以及德克萨斯大学西南医学中心Vamsidhara Vemireddy。

血脑屏障（BBB）是介于血液循环系统和脑部中枢神经系统之间的一种动态界面，通过严格调节血液和脑部的物质交换，维持脑部内环境的稳态平衡，但当颅内脑组织发生如脑肿瘤、中风、帕金森氏病、阿尔茨海默症等病变时，阻碍了许多潜在诊断剂和治疗剂的脑递送。目前已经报道了增加BBB通透性的生物以及生物物理方法，例如颈动脉注射高浓度甘露醇，血管活性试剂激活胞吞作用，利用细胞穿透肽、腺相关病毒（AAV）以及受体介导的转胞吞作用，以及循环气体微泡的聚焦超声（FUS）。目前，没有报道过增加BBB通透性的无创分子靶向方法。

作者的设计策略如图1所示。首先合成了一种金纳米粒子（AuNPs），静脉注射后特异性靶向血脑屏障上的紧密连接（TJ），再经颅皮秒激光刺激使BBB通透性增加，该策略允许免疫球蛋白和病毒基因治疗载体以及载有药物的脂质体进入脑，且此过程可逆，不会导致自发血管舒缩或神经血管单元结构的显著破坏。

图 1  增加血脑屏障通透性原理图。

作者通过抗体BV11修饰AuNPs合成目标分子（AuNP-BV11），抗体BV11能与TJ上的连接粘附分子A（JAM-A）特异性结合。为了检验AuNP-BV11靶向TJ的可行性，同时合成了只用聚乙二醇单甲醚（mPEG）修饰的AuNPs（AuNP-PEG）作为非靶向对照。分别静脉（IV）注射AuNP-PEG和AuNP-BV11利用银增强染色来观察金纳米粒子在脑血管的分布（图2b），AuNP-BV11能很好的聚集在脑血管壁周围，然而没有在脑血管壁观察到AuNP-PEG。经过电子显微镜（EM）对大脑超微结构成像显示AuNP-BV11与TJ共定位（图2c），AuNP-BV11在大脑中的积累量比AuNP-PEG高4倍（图2d）。接下来，作者在激光刺激下用三种分子示踪剂表征了BBB通透性变化。在IV注射后1 h用532 nm皮秒激光激发TJ靶向的AuNP-BV11，利用埃文斯蓝（与白蛋白结合，66 kDa）示踪显示，观察到BBB渗透性暂时增加。相比之下，所有对照组（单独激光激发、单独注射AuNP-BV11、全身给药AuNP-PEG后激光激发）均未能增加BBB渗透性（图2e）。作者又研究发现可以通过改变激光强度来调节BBB通透性增加的持续时间，观察到BBB渗透率在低激光密度（≤5 mJ/cm²）下6 h和在中、高激光密度（10-25 mJ/cm²）下72 h恢复到基线（图2f、g)。接着作者为了测试单次激光脉冲激发（5 mJ/cm²）后血脑屏障通透性增加的时间分布是否具有尺寸选择性，共同施用了不同分子量的示踪剂。在6 h内检测到小示踪剂（660 Da EZ-link生物素）的泄漏；而在激光激发后1 h内仅检测到大示踪剂（70 kDa FITC标记的葡聚糖）（图2h、i）。这种尺寸选择的现象表明泄漏从1到6小时逐渐关闭。激光激发后24小时观察不到这三种示踪剂的泄漏，BBB在此时间段内功能恢复。

图 2  通过皮秒激光刺激TJ靶向的金纳米粒子可逆调节BBB通透性。（a）经颅激光刺激示意图。（b）AuNPs在脑血管中的分布。（c）电镜下TJ与AuNP-BV11共定位。（d）脑部AuNP-BV11和AuNP-PEG积累量。（e）白蛋白结合伊文思蓝对泄漏可视化。（f）在不同激光密度和激光照射后的不同时间，白蛋白结合伊文思蓝泄漏进入大脑。（g）不同激光密度对结合白蛋白的伊文思蓝泄漏进入大脑的量化图。（h）不同大小分子量示踪剂泄漏进入大脑的量化图。（i）不同大小分子量示踪剂观测BBB渗透性。

为了探究BBB通透性增加的途径，作者选用电子致密示踪剂硝酸镧进行示踪，EM成像分析。对AuNP-BV11靶向大脑进行皮秒激光刺激，2 %硝酸镧（12.5 mL/min）经心注射。EM图像显示，在治疗区域内，51 %的TJ裂隙显示完整的镧（La）填充，49 %显示部分填充（集中在邻近管腔部位，图3a）。相比之下，在对照组织中（使用AuNP-BV11输注，无皮秒激光刺激），几乎100 %的TJ裂缝显示部分填充La（图3a）。进一步观察发现，La扩散到TJ裂隙之外并沿基膜进入大脑间隙空间（图3b、c）。接着作者对TJ宽度进行分析，在激光刺激后大部分TJ宽度大于10 nm，而未经激光刺激大多数TJ宽度小于10 nm（图3d）。这些结果表明，血脑屏障通透性增加是通过TJ裂隙的扩大而实现。

图 3  对BBB的调节涉及细胞旁扩散。（a）注入镧的脑微血管电子显微镜成像。（b）镧扩散到基底膜和间隙空间。（c）镧在激光区域的脑间隙空间分布。（d）TJ的电子显微镜成像以及TJ宽度分布图。

作者探究了调节BBB对血管动力和脑实质的影响。在皮秒激光刺激前后对小鼠的小动脉和小静脉进行成像分析（图4a-c）。进行傅里叶变换表明在低激光能量（5 mJ/cm²，1脉冲）下，小动脉血管舒缩（以0.1 Hz为中心）在调节BBB前后持续（图4d）。正如预期的那样，小静脉没有显示血管舒缩（图4e）。结果表明在低激光能量（5 mJ/cm²）下调节BBB不会损害自发血管舒缩。

图 4  调节BBB不破坏小鼠自发血管舒缩。（a）清醒小鼠头部薄颅骨荧光血管图像。（b）小动脉和小静脉直径变化。（c）小动脉和小静脉直径百分比变化。（d）小动脉傅里叶变换分析。（e）小静脉傅里叶变换分析。

另外，利用凝集素标记血管、免疫组化法（IHC）标记葡萄糖转运蛋白-1（Glut1）成像来观察对血管密度的影响，如图5a、b所示脑血管密度在激光前后没有显着变化。同时，又对脑超微结构中的神经元（NeuN）、轴突（Ankyrin-G）、星形胶质细胞末端足突（AQP4）、周细胞（NG2）利用IHC进行标记。如图5c、d、e所示，脑实质在激光前后没有显着变化。

图 5  调节BBB不改变脑血管密度，保留脑实质细胞结构。（a）番茄凝集素标记血管。（b）葡萄糖转运体1（Glut1）IHC染色。(c）神经元（NeuN）和轴突（Ankyrin-G）IHC染色。（d）星形胶质细胞端足的水转运体（AQP4）IHC染色。（e）周细胞（NG2）IHC染色。

最后，作者探究这种策略提供治疗剂（抗体、AAV和脂质体）的能力。通过标记IgG，可以在同侧脑半球中检测到注射的人IgG，而对侧脑半球则没有检测到IgG（图6a）。分析表明，激光治疗区域的平均荧光强度远高于非激光区域（图6d），证实了IgG成功递送到大脑中。在皮秒激光刺激AuNP-BV11后静脉注射AAV9-CamKII-GFP，1周后对NeuN进行IHC染色。分析显示，与对侧脑半球相比，64 %的皮质NeuN⁺神经元在同侧脑半球有清晰的GFP表达（图6b、e）。与非激光处理区域相比，激光处理区域中Dil-脂质体的荧光强度更高（图6c、f）。因此，利用此策略调节BBB将允许抗体、AVV和脂质体进入大脑。

图 6  调节BBB能够递送抗体、基因治疗载体和脂质体进入脑。（a）人IgG抗体进入大脑。（b）AAV-CamKII-GFP进入大脑。（c）脂质体进入大脑。（d-f）同侧（激光）和对侧脑半球（无激光）的人IgG（d）、AAV-GFP（e）和Dil脂质体（f）的定量和统计分析。

该团队设计一种简单的纳米技术，利用TJ靶向AuNPs的皮秒激光刺激来增加BBB通透性。这种方法可以递送免疫球蛋白、AAV和脂质体进入大脑。在低激光能量密度下不会损害脑血管动力，没有明显的神经元损伤。这项研究为AuNPs在生物医学领域的多功能应用铺平道路，为中枢神经系统的药物递送和治疗干预开辟新的途径。

作者：张馨

核稿者：刘丽

上传者：刘继红

原文链接:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.1c02996

原文引用：

https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c02996