今天分享一篇2022年发表在 Angew. Chem. Int. Ed. 上的文章。该文的第一位通讯作者是维尔茨堡大学的Hans M. Maric教授。Hans M. Maric教授主要从事开发并应用高端生物物理装置来研究蛋白质-蛋白质相互作用。第二位通讯作者是法国国家卫生研究院的Christian G. Specht研究员，他的研究方向是使用定量和动态单分子成像策略探索轴突和突触中分子相互作用的调节。
突触是指一个神经元的冲动传到另一个神经元或传到另一细胞间的相互接触的结构。突触主要由三部分组成，突触前膜、突触间隙和突触后膜。根据释放的神经递质的不同，突触可以分为兴奋性突触和抑制性突触。抑制性突触又可以分为甘氨酸能突触和γ-氨基丁酸（GABA）能突触。对突触进行标记，进而实现其可视化研究对基础神经科学和临床应用具有重要意义。
目前对抑制性突触的识别主要通过几种标志性蛋白实现，例如囊泡GABA转运体和GABA能突触的GABA受体γ2亚单位，或甘氨酸能突触的甘氨酸受体α1亚单位。其中最常见的抑制型突触标志物是突触后膜上的支架蛋白桥蛋白。桥蛋白存在于甘氨酸能突触和GABA能突触的突触后膜，起到固定突触受体的作用。对桥蛋白的识别与标记，就可以实现对抑制性突触的识别与可视化。目前对桥蛋白的标记方式主要有两种。第一种是采用基因标签的方式。即把发光蛋白与桥蛋白融合在一起，通过观察发光蛋白来确定桥蛋白的状态。这种方法可以用于活细胞和固定细胞的突触研究，在转基因动物中也可以应用。但是融合蛋白可能会对桥蛋白在细胞中的形态和功能产生影响，以及转基因的模型有限，限制了基因标签在突触研究中的发展。第二种是免疫染色的方法，利用抗原抗体相互作用的原理标记目标蛋白，来实现对目标蛋白的可视化。但是，这种方法不能用于活体，所用抗体的大小和与蛋白交联的趋势也会影响标记性能，对组织和复杂样本极其不友好，也限制了其在突触研究中的应用。对以上两种标记方法起补充替代作用的是用亲和力探针来标记。亲和力探针具有尺寸小、有助于组织渗透、结合目标蛋白的特定异构体或活性状态的优点。基于上述需求，作者设计了一种亲和力探针Sylite，它作为一种多功能工具来可视化不同尺度上的神经元结构。图 1 （A）TMR2i、SyliteM和Sylite的化学结构。（B）Sylite与桥蛋白E结构域结合的模型。（C）表达eGFP-桥蛋白和单独表达eGFP的COS-7细胞的荧光图。（D）TMR2i、SyliteM和Sylite的信噪比对比图。首先介绍一下设计策略。甘氨酸受体β亚基上的一段多肽是与桥蛋白亲和力最高的天然氨基酸序列。在之前的工作中，作者对这段天然氨基酸序列进行筛选，得到了具有更大亲和力的探针TMR2i。在这篇工作中，作者在TMR2i的基础上进行改造，得到了二聚体探针Sylite，以及Sylite的单体形式SyliteM，结构如图1A所示。由于桥蛋白具有二聚性，二聚形式的探针Sylite可以一次性与两个桥蛋白结合。作者模拟了Sylite与桥蛋白的结合方式（图1B）。随后，作者评估了Sylite可视化桥蛋白的效果。将表达融合了绿色荧光蛋白的桥蛋白的细胞和单独表达绿色荧光蛋白的细胞固定，用Sylite进行染色。如图1C，Sylite能够清晰地显示出桥蛋白的分布情况。作者还比较了三种探针的信噪比，可以看出Sylite具有超高信噪比（图1D）。图 2 （A)ITC法测定了桥蛋白E结构域滴定Sylite和SyliteM的热信号。（B）LC-MS/MS分析Sylite和SyliteM特异性。作者使用了等温滴定微量热法测Sylite对桥蛋白的亲和力。解离常数KD指引起最大效应一半（50 ％受体被占位）时的药物浓度。如图2A，测得Sylite对纯化后的桥蛋白E结构域的KD值为17.5 nM，比单体SyliteM的亲和力增加了11倍，表明探针具有很高的亲和力。除此之外，从图中还可以看出Sylite与桥蛋白反应的化学计量比是1:2，再次验证了其二聚体设计。利用LC-MS/MS技术，作者研究了探针的特异性。对全脑蛋白质组的Sylite相互作用组进行了分析。如图2B所示，桥蛋白具有最多的与Sylite反应的特异性多肽片段，说明Sylite对桥蛋白具有很好的特异性。图 3 （A）桥蛋白锚定突触后膜上的的甘氨酸受体GlyRs和GABA受体GABAARs。（B）用Sylite和桥蛋白抗体标记的桥蛋白异构体的图像。（C）探针与不同桥蛋白异构体相互作用的区域。随后，作者对探针能够靶向具有功能活性的桥蛋白异构体的性质进行了表征。桥蛋白具有多种异构体，有的异构体负责神经元传导，有的则与传导无关。与针对不一定是独有的或与特定蛋白质活性相关的蛋白质片段产生的抗体不同，Sylite被设计为一种功能探针，只与在神经元中发挥功能作用的异构体结合。如图3a，桥蛋白主要由三部分组成，C区，G区，E区。E区对GlyR β亚基具有较高的亲和力，也就是Sylite靶向的区域。作者比较了在HEK293细胞中表达的11种桥蛋白异构体的结合图谱（图3B）。图中显示了三种探针与桥蛋白的结合位点。其中，空白格表示缺失，斜纹格表示交换。从图中可以看出，Sylite只与E区结构比较完整的异构体结合。作者还选取了HEK293细胞中的桥蛋白异构体14进行成像。从图中可以看出，mAb3B11可以在转基因细胞中染色，但不能分辨细小斑点。Sylite不仅能标记重组的桥蛋白，还能清楚地显示重组蛋白积累的细小斑点。这表明Sylite非常适合于检测活性突触和量化功能上相关的受体结合位点。而mAb7a抗体没有成功标记桥蛋白，这是由于桥蛋白异构体14在HEK293细胞中发生了磷酸化，而mAb7a标记桥蛋白是由桥蛋白C区的一个磷酸化表位决定的。图 4 （A）用Sylite或SyliteCy3固定染色的原代野生型海马神经元的荧光图。（B）Sylite或SyliteCy3的皮尔逊共定位系数。（C）与感染神经元内参考信号mEos2-桥蛋白相比，mAb7a或Sylite标记突触的强度依赖图。（D）标记神经元突触前膜的RIM和突触后膜的桥蛋白示意图。（E）双色dSTORM可视化单个突触的平面投影和正面视图。（F）mAb3B11、mAb7a和Sylite分别测得RIM与桥蛋白之间的距离。在荧光显微镜中，两个或多个光谱通道的同时成像通常是评估一个生物学问题所必需的。具有荧光团和光谱通道选择的灵活性有利于节省时间和资源。因此，作者将Sylite原有结构上的Cy5荧光团换成Cy3，扩大了Sylite可应用的光谱范围。将两种Sylite探针应用于初级神经元，如图4A，Sylite和SyliteCy3都显示了神经元胞体中的抑制性突触和弥漫的桥蛋白，并且共定位系数也很高（图4B）。作者用Sylite和mAb7a对表达桥蛋白荧光融合蛋白的皮质神经元进行染色，发现Sylite和荧光信号，也就是与桥蛋白存在线性且更密切的相关性（图4C）。作者还对Sylite可用于纳米测量进行了验证。最近的研究表明，突触前活动区（AZ）蛋白RIM与桥蛋白形成跨突触纳米柱。RIM是突触前定位的蛋白，其主要功能是介导突触前囊泡的释放，并参与调控突触前可塑性。RIM与桥蛋白在突触前后膜对齐，也就相当于释放神经递质的囊泡与接受神经递质的受体对齐，这就能够保证信号快速有效的传递。为了确定RIM和桥蛋白之间的距离，作者在皮质神经元中分别标记了桥蛋白和RIM，然后使用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）对突触进行成像（图4D）。图4e分别是检测到的单个突触的平面投影和正面视图。如图所示桥蛋白与RIM的分布非常匹配。他们之间平均距离为129±24 nm，与文献数值一致。并且与mAb7a和mAb3B11相比，Sylite提供了更精确的读数（图4F）。图 5 （A）海马背侧切片DAPI（蓝色）和Sylite（绿色）染色的宏观图像。（B）海马体腹侧切片上Sylite染色的3D共聚焦图像。（C）细胞核和抑制性突触的三维体积表示。使用mAb3B11和Sylite共同标记了24小时的桥蛋白的截面侧视图。（D）染色24小时后，50 μm厚的小鼠海马区切片中沿Z轴（深度）的Sylite和抗体标记的分布图。作者还发现，Sylite具有优秀的组织穿透能力。传统的抑制性突触的组织染色是一项复杂而耗时的过程，通常仅限于小于等于16 μm的薄脑切片。而Sylite可以有效地穿透50 μm厚的组织切片，仅在一小时内就可以实现高对比度标记。作者首先使用20倍放大的荧光显微镜在宏观上观察了海马区抑制性突触的分布情况（图5A）。然后重建3D图像，得到抑制性突触的分布区域（图5B）。图5C是使用mAb3B11和Sylite共同标记了24小时后的切片侧视图。其中灰色代表mAb3B11和Sylite共同标记的桥蛋白，从图中可以看出mAb3B11只对分布于切片上下两端的桥蛋白进行了标记，切片中间部位只有用Sylite染色的桥蛋白。图5D更直观的显示了切片的染色情况。Sylite能对50 μm厚的切片进行均匀的染色，而mAb3B11和mAb7a的染色呈现三明治形状。图 6 （A）两组转基因小鼠的示意图。（B）中脑导水管周围灰质注射和表达定位的解剖示踪方案。（C）脑切片的单个dmPAG GABA能神经元胞体的三维重建。（D）在PAG dm区中，甘氨酸能突触靶向的桥蛋白簇平均比无甘氨酸能突触靶向的桥蛋白簇大。（E）在PAG dm区中，甘氨酸能突触投射对GABA能突触和谷氨酸突触中桥蛋白密度分布的影响。左：有甘氨酸能突触投射的GABA能突触和谷氨酸突触中的桥蛋白密度密度分布；中：没有甘氨酸能突触投射的GABA能突触和谷氨酸突触中的桥蛋白密度分布；右：dm区全部GABA能突触和全部谷氨酸能突触中的桥蛋白密度分布。导水管周围灰质（PAG）是一个中脑区域，它在协调对感知到的威胁的防御反应中起着重要作用。然而，其精确的回路机制及其神经解剖学基础仍有待阐明。PAG分为好多区，如图6B所示。作者首先使用细胞型特异性病毒介导的突触素免疫标记表达，从而使我们能够识别突触前末梢的甘氨酸。突触素也叫突触囊泡蛋白，是一种广泛分布于突触前囊泡膜并通过磷酸化形式发挥特定功能的特异性磷酸蛋白，可以较为精确的描述突触密度及分布状况。作者观察到这些神经元从PAG的vl区局部投射到PAG的dm区。接下来，为了识别PAG vl区甘氨酸能神经元的目标输出细胞，并表征抑制性突触后膜，作者选用两组小鼠，通过病毒介导PAG dm区中荧光蛋白的表达分别标记谷氨酸能神经元或GANA能神经元，并使用Sylite来识别突触后膜的位置。图C是3D重建的单个PAG dm区GABA能神经元细胞体(淡蓝色，透明)的大脑切片。在其中发现多个桥蛋白簇（绿色）。作者评估了Sylite所显示的突触后致密区的大小。发现被PAG vl区甘氨酸能突触靶向的桥蛋白簇比非甘氨酸能突触靶向输入的簇更大（图6D）。接下来，作者研究了PAG的vl区对dm区的甘氨酸能突触的投射情况，并确定了在dm区谷氨酸能神经元和GABA能神经元周围存在甘氨酸能突触前膜，表明PAG vl区甘氨酸能神经元可能在两个功能不同的dm区神经元中发挥抑制作用。并且，作者发现有甘氨酸能神经元投射的GABA能和谷氨酸能神经元中的桥蛋白密度几乎一样，但是没有甘氨酸能神经元投射的GABA能神经元具有比谷氨酸能神经元高的桥蛋白密度，dm区GABA能神经元和谷氨酸能神经元总的桥蛋白密度相比，GABA能神经元的桥蛋白密度更高，说明GABA能神经元接受了更强的抑制性输入（图6E）。综上所述，通过对结合序列的系统改进、荧光染料的裁剪和二聚作用，该文设计了一个具有高度选择性和亲和力的抑制性突触探针Sylite。与传统亲和探针相比，该探针的优势包括具有线性读出的功能抑制突触选择性标记、快速和直接的组织染色以及与超分辨率显微镜的兼容性。与先进的成像技术相结合，合成探针，如Sylite，开辟了神经科学的新研究途径，因为它们使多重研究成为可能，并可以实现更好的定位精度、分辨率和组织染色。未来，Sylite衍生物也可能与新的细胞穿透技术协同使用，从而促进活细胞成像和功能靶向，在体内应用和药理学研究。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ange.202202078DOI: https://doi.org/10.1002/ange.202202078