今天分享一篇2022年发表在 Signal Transduct. Target. Ther. 上的文章，该文的通讯作者为四川大学华西基础医学与法医学院的雷鹏教授、Lunzhi Dai和Biao Dong。雷鹏教授的研究方向是神经系统认知功能障碍相关疾病的分子机制及治疗策略。Qing-zhang Tuo为该文的第一作者。
脑卒中是最常见的致死疾病之一。其中，缺血性脑卒中最为常见（约占80%），其发病机制为血凝块阻塞了供应大脑的血管，使大脑失去能量和氧气供应。由此导致的脑损伤从脑卒中20分钟后开始，并可持续10天，造成的影响可持续数年，其中三分之一的脑卒中患者会终身残疾。
脑卒中的主要治疗策略是通过药物或机械溶栓来恢复流向大脑的血液。然而，由于脑卒中后时间窗有限（＜4.5小时），存在再通率适中、出血风险以及其他临床禁忌症等，并不是所有患者有资格接受机械溶栓或者药物治疗；残留的小体积的血栓容易堵塞其他小动脉，并不是所有患者都能得到临床症状的改善；溶栓后的血液再灌注会使脑部遭受氧化应激，造成神经元进一步的损伤及死亡。因此，迫切需要开发其他治疗方法，特别是能够预防神经元损伤及死亡的治疗方法。
不幸的是，在过去的10年里，尽管在实验室层面开发了许多神经保护剂，但只有少数药物如抗氧化剂、他汀类药物和抗凝剂等通过了III/IV期临床试验并最终应用到临床。这一转化“障碍”强调了进一步了解脑梗死后细胞损伤和死亡的机制的必要性。
缺血性脑卒中的病理生理学为几种细胞死亡机制的发生提供了可能性，这可能是有希望的干预靶点。例如，在缺血阶段，氧气和葡萄糖供应的缺失严重限制了ATP的产生，使得神经元膜电位调节失败，导致多种毒性级联反应，包括兴奋性毒性、线粒体功能障碍、局部酸中毒、蛋白质错误折叠和炎症。在兴奋毒性级联反应中，葡萄糖和氧气的剥夺导致细胞膜去极化，谷氨酸释放，使神经元凋亡和坏死；在再灌注阶段，即使神经元在缺血阶段存活下来，它们在再灌注阶段时迎来二次重创——氧化应激。随着ROS升高，抗氧化剂系统的防御能力减弱，抗氧化剂酶失活和抗氧化剂消耗。这会导致多种有害事件，使神经元凋亡和坏死。这就是为什么针对氧化应激是一种合理的治疗方法，特别是，铁依赖性的铁死亡通过过量的脂质过氧化导致细胞死亡，这可能导致脑卒中中神经元的死亡。之前研究发现，缺血性脑卒中脑中确实存在铁死亡，导致神经元的死亡，但其激活机制并不清楚。因此，研究脑缺血再灌注过程中引起铁死亡的关键蛋白或通路，可为预防缺血性卒中后神经元死亡提供新的靶点。为了研究脑缺血/再灌注过程中引起铁死亡的关键蛋白或通路，作者利用脂质代谢组学、蛋白质组学和免疫组化等手段，发现凝血酶及其花生四烯酸代谢下游的ACSL4是参与I/R中铁死亡诱导的细胞死亡通路中的关键蛋白（图1），从而对缺血性脑卒中铁死亡的生物学机制有了新的认识，该通路可能为治疗缺血性脑卒中提供新途径。图 2 小鼠脑I/R后海马组织中的脂质代谢组学分析
虽然有几项研究表明，铁死亡与缺血性脑卒中有关，但其激活机制尚不清楚。由铁死亡引起的细胞死亡是由于有毒的脂质氢过氧化物积累超过细胞解毒能力所致。花生四烯酸（AA）含有磷脂酰乙醇胺（PEs）特别容易受到亚铁过氧化作用的影响。通过对小鼠缺血性脑卒中后海马组织的高质量非靶向代谢组学分析，作者发现了四种显著减少的磷脂，即PC（36：4）、PE（42：8)、PE（38：6p）和PE（40：7）。进一步分析其脂肪酸侧链发现PC（36：4，16：0/20：4）、PE（42：8，22：4/20：4）和PE（38：6p，18：2p/20：4）的脂肪酸侧链中均含有AA，且AA（20：4）为优势（图2j），这与小鼠缺血性脑卒中后海马组织游离AA显著增加一致。为了探索缺血性卒中后导致AA升高的蛋白，作者对同一组织进行了蛋白质组学分析。基于差异表达蛋白的富集，作者发现血小板激活、信号转导和聚集是上调最多的途径（图3d，e）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析也一致指向相同的途径（图3f），凝血酶原（F2基因编码凝血酶原，也称为凝血因子II），凝血酶原酶是上调最多的蛋白质（图3g），通过WB实验进一步得到证实（图3h）。随后，作者探究了人脑I/R后凝血酶的来源。为了研究缺血性卒中期间凝血系统的变化，作者收集了59份血清样本，包括27例健康对照和32例缺血性卒中患者，在去除血清中高丰度蛋白后，进行蛋白质组学分析。作者在缺血性卒中血清中共发现28个蛋白上调，21个蛋白下调。其中，缺血性脑卒中患者血清中纤维蛋白凝块形成明显上调（图4g)，这与小鼠大脑中血小板聚集增加一致(图3f)。然而，与健康对照组相比，血清中凝血酶水平没有显著升高（图4l），表明作者在说明在海马组织中观察到的凝血酶升高（图3h）可能不是来自血液，而是直接产生于大脑。接下来，作者探究了凝血酶介导神经元铁死亡的方式。凝血酶是缺血性脑卒中的主要药物靶点之一，其作用是刺激纤维蛋白的产生和凝血。然而，凝血酶先前已被证明可诱导细胞凋亡。作者发现凝血酶剂量依赖性诱导N27神经元细胞死亡（图5a），伴随AA升高（图5b）和脂质氢过氧化物（图5c，d），线粒体变小，膜密度增加（图5e），这些特征都与铁死亡症一致。凝血酶不影响细胞内铁亚铁的水平，这不是诱导铁死亡的必要条件（图5f）。更重要的是，凝血酶诱导的细胞死亡可通过治疗铁死亡抑制剂利普司他汀-1（图5g）和谷胱胱肽前体N-乙酰-L-半胱氨酸（图5h）和cPLA2α抑制剂Darapladib（图5i）来预防。凝血酶抑制剂达比加群（Dabigatran）目前正在进行缺血性脑卒中III期临床试验。作者发现达比加群在N27神经元培养中保护细胞不受I/R氧葡萄糖剥夺（OGD）模型的影响，并缓解MCAO/再灌注（MCAO/R）大鼠的神经症状和减少脑梗死体积。由于OGD和MCAO模型都不涉及可能与凝血酶抑制有关的血栓形成，这些发现提示凝血酶诱导的额外病变是由达比加群阻断的。总的来说，以上数据强调了凝血酶诱导铁死亡的可能性，这可能与缺血性脑卒中有关。作者进一步探究凝血酶介导神经元铁死亡的方式。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）是一种参与脂质代谢的重要酶，通过将游离的AA转化为花生四烯酰辅酶A生成脂质氢过氧化物而参与铁死亡。作者发现凝血酶处理后N27细胞中ACSL4降低，但不影响ACSL4 mRNA表达。作者还发现，通过western blot（图6b）或组织学（图6c）检测，MCAO/R后大鼠同侧海马ACSL4表达随着时间的推移类似地减少。ACLS4在i/R后3小时明显下降，这早于i/R后6小时开始的海马神经元丢失（使用NeuN评估存活神经元，使用Fluoro-Jade评估退化神经元）（图6d，e）。然而，凝血酶在缺血早期显著升高（图6f）。这些数据表明ACSL4的下调是大脑I/R的早期事件，独立于神经元死亡发生，这可能是对凝血酶诱导应激的保护性反应。为了阐明凝血酶细胞毒性是否由ACSL4介导，作者使用基于CRISPR-cas9的基因编辑生成了ACSL4敲除(KO)N27细胞，并使用含有ACSL4表达盒的慢病毒载体pLentio-OE-rASCL4生成了ACSL4过表达（OE）细胞。WB实验证实了这两种模型的构建（图6g）。结果表明，凝血酶可能通过促进ACSL4依赖性的铁死亡而促进神经元细胞死亡，ACSL4的降低可能有助于对抗凝血酶诱导的铁死亡损伤。最后，作者通过调节ACSL4的表达观察是否改变脑I/R损伤结果。为了确定ACSL4是否影响脑I/R后的预后，作者通过单次注射腺相关病毒载体，即AAV8-mACSL4（过表达，OE）和AAV8-EF-Cas9+AAV8-mACSL4-sp.g3（敲除，KO），在小鼠左海马CA3区（小鼠MCAO/R最脆弱的区域）选择性过表达或敲除ACSL4，并在MCAO啮齿动物模型中检测效果（图7a）。以AAV8-EGFP（带有增强型绿色荧光蛋白的AAV8）作为对照。免疫荧光染色证实了转导的有效性（图7b）。在同样的30分钟MCAO/R条件下，与EGFP小鼠相比，ACSL4 OE小鼠在再灌注后5天内表现出梗死体积显著增加（灌注后24小时，图7c），神经评分恶化（图7d），旋转运动性能更差（图7e）。相比之下，与EGFP小鼠相比，ACSL4 KO小鼠对I/R损伤具有保护作用，其表现为梗死体积减小（图7f），神经评分（图7g）和运动协调能力（图7h）明显改善。与铁死亡抑制剂一致，ACSL4 KO小鼠和对照组小鼠在永久性MCAO后神经元损伤没有差异（图7i，j），这强烈表明该模型在再灌注过程中发生了铁死亡。由于实验性脑卒中研究的一个主要问题是动物模型的可重复性，这些在小鼠中的结果在大鼠中得到了复制。激光散斑信号表明，敲除ACSL4不影响MCAO/R后大鼠皮层的血流（图7k，l），证实ACSL4 KO并非单纯通过影响血流动力学而具有保护作用。AAV辅助的ACSL4敲除在大鼠皮层中对I/R诱导的功能损伤具有显著的保护作用（神经评分；图7m）和脑梗死体积（TTC染色；图7n）。由于实验性脑卒中研究的一个主要问题是动物模型的可重复性，这些在小鼠中的结果在大鼠中得到了复制。激光散斑信号表明，敲除ACSL4不影响MCAO/R后大鼠皮层的血流（图7k，l），证实ACSL4 KO并非单纯通过影响血流动力学而具有保护作用。AAV辅助的ACSL4敲除在大鼠皮层中对I/R诱导的功能损伤具有显著的保护作用（神经评分;图7m）和脑梗死体积（TTC染色；图7n）。综上所述，由于缺血性脑卒中后神经元死亡的机制尚不清楚，为了研究脑缺血/再灌注过程中引起铁死亡的关键蛋白或通路，作者利用脂质代谢组学、蛋白质组学和免疫组化等手段，发现凝血酶及其花生四烯酸代谢下游的ACSL4是参与I/R中铁死亡诱导的细胞死亡通路中的关键蛋白，从而对缺血性脑卒中铁死亡的生物学机制有了新的认识，该通路可能为治疗缺血性脑卒中提供新途径。https://www.nature.com/articles/s41392-022-00917-zhttps://doi.org/10.1038/s41392-022-00917-z