作者：杨晓飞
转载自公众号：思影科技
fMRI因为能够提供对大脑功能的独特洞察而受到医生和研究人员的广泛欢迎。然而，我们必须考虑多种技术因素，从实验设计到数据采集、数据处理以及方法的内在限制，以优化fMRI分析并对数据作出最准确和最有根据的解释。实际研究过程中，研究者/临床医生必须从许多可用的选项中选择每个阶段最合适的软件工具。在这里我们提供简单的指南，包含主要的分析阶段，每个阶段涉及的技术和工具。这份指南旨在作为神经成像社区的资源，帮助新手克服最关键的困难。本文由葡萄牙学者发表在Frontiers in Neuroscience杂志。fMRI技术被广泛应用于认知神经科学领域（比如感知运动功能、语言、视觉空间、注意、记忆、人格、决策、执行功能）以及成瘾、神经营销等等。另一个主要研究领域为临床神经成像（比如手术前后的状态对比、基因相关的功能研究等）。最后一个较为新兴的领域是结合实时神经反馈或脑机接口治疗疾病比如强迫症、抑郁症、精神分裂。静息态是最简单直接的实验设计，被试不需要完成任何外在任务。这种情况下收集到的数据具有一致稳定的功能模式，被称为静息态网络（Resting State Networks ,RSNs)。
最经典的实验设计为闭眼静息（数据收集过程中，被试眼睛闭上，不要想任何事情也不要睡着）和睁眼静息（数据收集过程中，被试眼睛睁着视线固定，不要乱动不要想任何事情）。真实研究中选何种设计，由研究目的决定。扫描时长也会对结果产生影响，一般为5—7min，如果是儿童被试可适当缩短比如5.5分钟。任务态fMRI研究中，刺激的呈现方式至关重要。最经典的实验设计为block设计、event设计和混合设计三种。其中最简单的实验设计是block设计，其包含一系列的block，每个block里面呈现1种条件的刺激。Block之间的间隔取决于刺激类型，通常为15-30s。每个条件呈现的顺序也很重要，通常要在被试间平衡。Block设计的优点是方法简单、统计功效良好、信号鲁棒，缺点是被试会产生练习效应并且无法准确定义响应时间。Event设计旨在描述大脑功能与离散事件的相关，刺激顺序随机，刺激间隔（inter-stimulus interva，ISI）通常在0.5-20s。这一任务增加了不可预测性，提供了有效手段检测局部血流动力学反应的瞬态变化，但同时也造成信噪比降低、分析过程变得复杂，最终导致检测能力下降。Event设计还分为2种类型，其差异来自ISI的范围：一是慢事件相关设计（slow event-related designs），其ISI通常在15s以上，这样可以防止刺激间HRF的重叠；另一个是快事件相关设计（rapid event-related designs），刺激间的间隔时间短（短于先前刺激的HRF），导致刺激间HRF的重叠。此外，刺激呈现顺序设置为随机或伪随机，也可有效减少练习效应。对于快速事件相关设计，jitter设计则允许出现不同的HRF重叠，可以减少多重线性问题并更好的表征每种条件的反应。混合设计结合了block设计和event设计的优点，能提供持续和瞬间功能激活情况。不过，它需要更多的假设，对HRF的估计较差，持续信号的统计效应变低，需要更多的被试量。最后，当研究同时涉及静息态和任务态时，建议先扫描静息态。
（A）数据基本特征（B）静息态（C）block设计（D）event设计（E）混合设计（F）采集技术（G）伪影（H）质控（I）格式转换。预处理步骤：（J）时间层校正（K）头动校正（L）空间标准化（M）平滑（N）滤波。（O）基于任务态的分析方法（P）基于静息态的分析方法（Q）统计界面（R）可视化。fMRI研究因为样本量少、比较次数多导致统计效应低而一直为人诟病。另外也由于BOLD响应的不确定性等原因导致fMRI研究较少计算效应量。好在现在已经开发出了专门的工具，只需输入平均激活、方差、Ⅰ类错误的概率（alpha level）等即可计算。已有的软件有：PowerMap software、fMRIPower tool、NeuroPower。BOLD信号检测是最常见的技术，其他的一些技术有脑血容量（cerebral blood volume，CBV）、脑血流量（cerebral blood flow ，CBF)和脑氧代谢率（cerebral metabolic rate of oxygen，CMRO2)。动脉自旋标记（Arterial Spin Labelling，ASL）利用动脉血液中的水分子作为内源性对比剂实现脑血流成像；血管空间(Vascular-Space-Occupancy,VASO) 基于血液和周围组织的差异并通过局部CBV的动态测量确定; Venous Refocusing for Volume Estimation(VERVE)基于静脉脑血容量变化；扩散加权MRI测量激活过程中与细胞肿胀有关的神经组织的结构变化。最后，收集数据时需要获取特定的序列。常见的扫描序列为平面回波序列（echo planar imaging，EPI）。在采集阶段，收集到高质量的数据是至关重要的。关于收集技巧并没有黄金原则，因为参数设置都不大一样，这里仅针对标准单镜头梯度回波EPI 3T（a standard single-shot gradient-echo EPI 3T）核磁数据采集提供一些建议。所有因素中对磁共振结果影响最大的是磁场强度，随着场强的增加，灵敏度、分辨率和信噪比均得到提高。目前使用较多的是1.5T~3T，但是一些研究中心已有7T设备。另外一个因素是扫描顺序，间隔扫描还是连续扫描，升序（foot-to-head）还是降序（小编注：请扫描时做好记录，后续分析会用上）。间隔扫描虽然可以减少相邻层的干扰，但更容易受到头动等影响。为了减少这些影响，扫描时层与层之间会存在间隙（通常是层厚的10%~25%）。目前保险的方法是选择连续降序扫描。磁共振成像还需考虑时间分辨率和空间分辨率的权衡，由于BOLD信号随时间改变，因此优化时间分辨率是关键。目前TR普遍为2-3s。对于任务态研究，通常会选择较短的TR，不过这会导致信噪比显著降低。优化时间分辨率时肯定会牺牲空间分辨率，其中一种方法是在保证全脑覆盖的同时进行多层平行成像，比如GRAPPA、SENSE、multiplex-EPI。GRAPPA和SENSE的工作原理是减少扫描单层影像所需时间，增加敏感度；multiplexed-EPI是一次不止扫描一层。另外还有一些建议：当既有静息态研究又有任务态研究时，数据采集参数尽量保持一致，这样在进行结果对比时比较准确。任务态研究中最重要的是数据扫描和刺激呈现的同步，这个可以通过发送trigger实现。（同步器是必备的任务态同步设备）磁共振成像的伪影通常来自脉冲序列、梯度系统硬件、采集策略以及生理噪音。EPI序列有3种常见的伪影：空间形变（figure1 g1）、信号流失（figure1 g2）、鬼影（figure1 g3）。空间畸变可能是由于磁场不均匀性造成的，局部表现为沿相位编码轴的拉伸或压缩像素，在较高的场强下更差，改善的方法有使用匀场线圈、field mapping、point spread function mapping、反向相位梯度。近场不均匀引起的信号流失通常会在额叶和颞叶发生，改善的方法有：选择合适的回波时间（当回波时间和感兴趣部位的局部T2匹配时，BOLD信号对比最好）、层厚更薄、优化倾斜度、改善相位编码的方向等。鬼影只发生在相位编码方向，因为K-space的奇偶行极性相反，改善的方法有使用多回波扫描、二维相位校正、采用GRAPPA进行平行成像等。硬件方面，扫描仪、头部线圈的异质性、射频干扰等均会影响成像质量，改善的方法是进行独立成分分析（ICA）或鲁棒主成分分析（Robust Principle Component Analysis，RPCA）。生理噪音比如头动、呼吸、心跳等，其中最常见影响最大的就是头动，所以在预处理的时候会进行头动校正。数据收集的最佳方案是用柔软的填充物固定头部，尽量防止运动。至于呼吸、心跳，采集层面需要借助磁共振兼容的心跳、血氧等设备，分析层面可采用滤波的方式。幸运的是现在已经开发出了大量的软件来减少伪影的影响，比如：Artifact detection Tool (ART—http://www.nitrc.org/projects/artifact_detect/),http://www.mccauslandcenter.sc.edu/CRNL/tools/part)(http://www.translationalneuromodeling.org/tnu-checkphysretroicor-toolbox/)(http://cibsr.stanford.edu/tools/human-brainproject/artrepairsoftware.html)FMRIB’s-based Xnoisifier (FIX) (http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FIX) (http://www.icn.ucl.ac.uk/motorcontrol/imaging/robustWLS.html)
第一次质控是在数据采集时，一边扫描一边浏览数据非常重要。采集完成之后确保所有被试的数据都被正确导出，并借助Osirix, MRIcro, RadiAnt,ImageJ等查看原始图像是否存在问题，然后将原始图像转换为.img/.hdr文件或.nii文件方便预处理。常用的转换工具有：(https://www.nitrc.org/plugins/mwiki/index.php/dcm2nii:MainPage)(https://lcni.uoregon.edu/downloads/mriconvert/mriconvert-and-mcverter)(http://nipy.org/nibabel/index.html)在刚开始采集的时候，机器需要时间进行预热，因此前几秒的数据通常是不稳定的需要去除，一般是去除前10秒的数据。举例来说，如果TR是2秒的话，则是去除前5个时间点。采集数据时，机器是一层一层扫描的，不同层获取存在时间差，时间层校正的目的就是把数据调整成好像是在同一个时刻瞬间扫描完成的。时间层校正的效果取决于实验设计，效果由大到小依次为event设计、block设计、静息态。不过它也不会对结果产生坏的效果，一般建议都处理一下。至于时间层校正和头动校正谁先谁后，通常建议如下：隔层扫描的话先时间层校正后头动校正，连续扫描的话先头动校正后时间层校正；头动较小的被试先时间层校正后头动校正，头动较大的被试先头动校正后时间层校正。头动校正是为了对齐各个时间点的图像，一定程度上消除头动的影响，因为头动会造成体素的错位。最常见的方法是选择一张图像作为参考，通常是平均图像，然后将所有体素进行刚体变换与参考图像对齐。空间标准化是为了对齐各个被试的图像，保证相同的体素对应的各个被试的解剖结构是一致的。配准一般会用到坐标系，在fMRI领域有2大标准坐标系，一是基于单个被试的T空间，一是基于大量被试的MNI空间，这些坐标体系确保所有被试的解剖结构是一致的。MNI空间和T空间也可以进行转换，常见的工具有：(GingerALE,http://www.brainmap.org/icbm2tal/) (BioImage Suite,http://bioimagesuite.yale.edu/mni2tal/)目前的配准方式主要有2种，一是EPI配准也即一步配准法，二是T1配准也即两步配准法。EPInorm：通过仿射变换将EPI图像非线性配准到标准空间中的EPI模板。这种方法的优点在于它直接解决了EPI图像的非线性，但缺点是可能存在过度校正（如用不相关的脑区来填充信号丢失区域）。T1norm：通过被试的EPI图像与T1图像之间进行仿射变换，然后将T1和T1MNI模板进行非线性变换，将变换参数应用于EPI图像，从而得到MNI归一化的EPI数据。这种方法的优点是它通常依赖于具有较高空间分辨率的T1像来估计对MNI空间的非线性扭曲。但缺点是没有考虑到几何失真对EPI数据的影响，因为这种方法假设仿射变换可以校正同一被试EPI和T1数据之间的任何差异。至于选择何种配准方式，没有定论，重点是配准的效果。空间标准化完成后通常进行空间平滑（也可以叫空间滤波，spatial smoothing/filtering），因为normalize是仿射变换，会产生形变和噪声，而平滑可以降低仿射变换的影响并提高统计效力。平滑之后体素会与周围的邻居变得接近（因为求的平均），图像会变得模糊。平滑核大小通常是体素大小的2倍。预处理的最后一步是时间滤波，滤波的目的也是降噪。核磁信号多为低频信号，而fMRI噪声可能与缓慢的扫描仪漂移(∼<0.01 Hz)以及心脏(∼0.15 Hz)和呼吸(∼0.3 Hz)效应有关，所以目前常见的滤波范围是∼0.008-0.01 Hz，静息态通常采用0.01—0.08Hz。
表4 主要的处理工具中可分析的指标
任务态最常见的方法是在SPM中利用GLM进行一阶建模然后分析，这一方法目前仍然很受欢迎。任务态的功能连接也越来越受关注，生理心理交互（PPI）就是其中一种方法，具体包括2个方面：一是测量脑区之间（生理）是否有关联，二是这些关联是否受到心理变量也即实验条件的影响。有效连接包括动态因果模型（DCM）和格兰杰因果分析（GCA）。DCM流程如下：刺激输入引起神经活动变化 ——> 神经活动变化进而引起血管舒张、血流变化、血容量变化以及脱氧血红蛋白变化 ——> 脱氧血红蛋白变化进而引起BOLD信号改变。DCM模型包括2部分：神经活动状态方程和信号生成方程（过程较复杂，不再赘述）。GCA的基本思想是对于时间序列X(t)和Y(t)，如果添加利用Y(t)过去的信息，比单纯地利用X(t)过去的信息预测 X(t)的效果要好，那么称Y(t)对X(t)有贡献，存在由Y(t)到X(t)的格兰杰因果。该过程通过确定时间序列的优先级然后推导出因果关系。历史上，第一个应用于静息态的方法是基于种子点的相关分析——定义好一个种子点，求它与全脑其他体素的相关。REHO（Regional Homogeneity analysis）是利用肯德尔和谐系数计算体素与其周围体素的一致性。ALFF和fALFF反映脑区自发活动的强度，ALFF关注信号低频振幅的强度，fALFF关注某个特定频段内的信号振幅强度对可探测到的全频段范围内信号的强度。数据驱动的分析方法有PCA（主成分分析）、ICA(独立成分分析)、聚类（cluster）。主成分的有效性很大程度上取决于假设的线性度、主成分的正交性和高信噪比，所以可应用于任务态。静息态目前多用ICA。ICA将信号按照统计独立的原则，通过优化算法分解为若干相互独立的成分，以便于分别进行处理，它的建立基础在于假设源信号的统计独立性。静息态数据通常使用空间ICA，任务态数据主要使用时间ICA。聚类是将数据集合分成由类似对象组成的多个类的过程，和ICA类似，但是效果更好。越来越受欢迎的脑网络分析方法是图论网络，其假设大脑由节点（脑区）和连边（节点间的连接）组成，这使得脑区之间能相互建立连接，可分析的指标包括全局属性、节点属性和连边差异。不过，单靠静态功能连接分析无法准确描述大脑的动态功能状态变化，因此衍生出了动态网络。追踪大脑功能连接的动态性可以为研究脑网络的基础性质和描述大脑的功能活动的动态性提供更多视角。最常用的方法是滑动窗分析技术。图2 fMRI研究中常用的分析方法。
对于任务态有GLM（A）、PPI（B）、SEM（C）、DCM（D）、GCM（E）、多体素模式分析（F）。对于静息态有基于种子点的相关（G）、Reho(H)、ALFF（I）、PCA（J）、ICA（K）、clustering（L）、图论网络（M）、动态功能连接（N）。
统计模型为GLM模型，常见的分析方法有T检验、方差分析，协变量需考虑。统计时可全脑进行，也可选择自己感兴趣的脑区（基于假设）。统计结果均需进行校正，校正方式有2大类：基于体素水平的校正（family-wise error rate、false discovery rate）和基于cluster水平的校正。FWE较为严格，FDR相对宽松。实现校正的工具有AFNI、FSL、SPM等。另外一种校正方式TFCE（hreshold-free cluster enhancement）可通过FSL实现。通常ROI统计更易出结果，因为其多重比较校正仅限于ROI内部。最后，目前的统计结果基本需要汇报效应量。使用不同的神经成像方法收集多模态数据已经变得越来越流行，这为研究更全面的大脑结构和功能提供了机会，无疑是未来的趋势。几个世界级别的研究如:Human Connectome Project, Developing Human Connectome Project , Baby Connectome Project已开展相关研究，将功能像与结构像结合起来。另外，也有将fMRI与EEG、MEG、fNIRS、TMS等结合。通常需要报告peak点坐标（X Y Z），cluster size 、多重比较校正的方式、统计值、脑区名称以及脑图。方法和结果尽可能详细描述，保证可重复性。结果解释一定要参考前人文献、有依据，在此基础适当拓展。fMRI目前在脑功能研究中很受欢迎，并有望在未来变得更加突出。本文旨在为新手提供fMRI研究的一套指南，从实验设计、数据采集到数据分析和结果汇报，希望能对大家有所帮助。PS：后台回复关键词“fMRI研究指南”即可获得原文及参考文献啦！
参考文献
[1]Soares José M., Ricardo, M. , Moreira, P. S. , Alexandre, S. , Edward, G. , & Adriana, S. , et al. (2016). A hitchhiker's guide to functional magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience, 10.
Analyer脑电数据处理指导手册