ELISA 大侦探：各种疑问难不倒｜ELISA 那些事儿

近期，又一部童（bao）年（lu）回（nian）忆（ling）的大片《大侦探皮卡丘》上映，有没有被萌即是正义的皮卡皮卡迷倒？跟大侦探抽丝剥茧地寻找真相一样，我们凭借近 40 年的 ELISA 开发经验，总结出 ELISA 实验过程中的常见问题及针对性解决方案，帮助你快速找到问题症结所在，从而对症下药。

图片来源：电影《大侦探皮卡丘》

问题一：无信号或信号低
可能原因	解决方案
1.1 加样次序不正确或准备操作不当	重做实验
检查计算过程，标准品重溶等
1.2 标准品毁坏	避免剧烈震荡
更换标准品
1.3 孵育条件不当	确认孵育温度，是否需特殊摇床
1.4 不合适的滤光片	检查使用的滤光片参数是否和说明书建议的波长匹配
1.5 存储方式不当	根据试剂盒标签正确存储

问题二：信号太强，整板变蓝
可能原因	解决方案
2.1 漂洗不充分	参照洗涤步骤
2.2 底物混合过早	混合后需立即使用
2.3 封板膜或试剂容器的重复使用导致HRP残留	每一步使用新封板膜及试剂容器
2.4 工作台用漂白剂做过清洁	残留漂白剂可以氧化 TMB 导致非特异性高信号，需去除残留

问题三：标准曲线可以得到，但各点间区分度差
可能原因	解决方案
3.1 平板显色反应时间不够长	增加底物溶液孵育时间
使用推荐的时间
3.2 操作步骤不正确	严格按照说明书
3.3 标准曲线稀释计算不当	检查计算过程，重新制作标准曲线
3.4 漂洗不充分	如使用自动洗板机，确保清洁无堵塞
增加 30s 浸泡时间
洗涤中途旋转平板
3.5 封板膜重复使用	每步使用新的封板膜

问题四：复孔重复性差
可能原因	解决方案
4.1 未使用封板膜	使用封板膜
4.2 漂洗不充分	参照洗涤步骤
如使用自动洗板机，确保清洁无堵塞
4.3 孵育温度变化	尽量在温度变化小的地方进行孵育
4.4 操作流程变化	保持操作流程一致
4.5 封板膜重复使用	每步使用新的封板膜
4.6 加样操作变化	枪头紧密安装，确保放液体积一致
确定使用同种移液方法
4.7 摇床不合适	确定摇床轨道及速度符合说明书参数要求
4.8 唾液污染	带上口罩以防污染

问题五：该有信号却没有，而标准曲线正常
可能原因	解决方案
5.1 样本中无指标或浓度低于检测范围	重复试验
获取新鲜样本，最小化反复冻融
使用酶抑制剂
5.2 样本基质效应掩盖了检测信号	进行梯度稀释观察回收率变化
按照试剂盒说明正确进行样本处理

问题六：样本读值太高，标准曲线正常
可能原因	解决方案
6.1 因子表达水平超过检测范围	稀释样本后检测

问题七：整板读值低
可能原因	解决方案
7.1 检测波长不正确	检查酶标仪设定
7.2 显色不充分	增加显色时间
7.3 包被的平板陈旧、毁坏	包被新的平板
7.4 捕获抗体未与平板结合	使用 ELISA 平板（而不是组织培养平板）
用未添加其它蛋白的 PBS 稀释
7.5 重溶抗体的缓冲液含有 FCS	使用合格的试剂

问题八：HRP 标记链霉亲和素后，加入终止液后溶液成绿色
可能原因	解决方案
8.1 混合不充分	适度拍板，使混合均匀

问题九：边缘效应
可能原因	解决方案
9.1 温度不均	避免工作环境的温度变化
使用封板膜

问题十：漂移
可能原因	解决方案
10.1 检测准备工作有中断	保证连续性，检测前正确准备标准品和样品
10.2 实验前试剂未置室温	确保试剂加样前处于室温，除非特别组分指明不同温度的放置方式

实验结果一旦出现问题，原因往往是多方面的，要一一排查。因此实验过程中需严格按照说明书执行，同时需要注意 ELISA 实验的小技巧，看似简单如螺丝钉的细节，可能会决定实验成败。

确保所有试剂在使用前已达到室温（除非指明要保持低温的）。

如果你不打算用完整块平板，确保剩余的 8 联管放回有干燥剂的平板袋中并密封，以防水汽使产品效果下降。

对于不是一次性使用的标准品，最好把剩余的标准品小量分装并冻存。这使标准品免于反复冻融。

多通道移液枪可使你的标准品和样品加样能力加快，并取得一致性更高的结果。

移液操作进行放液时枪头与垂直方向偏离一点角度，不要触碰样品孔底部。

复孔的样品加样时不需要换枪头；为避免样品污染，取不同样品或标准品时要换枪头。

强烈建议使用洗板机，手工洗板可能导致更高的背景。

在洗板时，无论是手工还是用洗板机，在两次洗涤中增加 30 秒的浸润时间，以确保洗涤的效果。

小心注意孵育时间。通用的建议是每小时的孵育时间的误差要控制在+/-5 分钟以内。

如果试验要求在 2-8 度的低温孵育，并且你同时进行多块板的操作时，不要把平板互相叠放，要并排分别放置。

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