Nature protocols | SMA —— 一种在自然脂质中无detergent提取膜蛋白的方法

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细胞膜为细胞提供了一把保护伞，不仅保证了细胞内各种生理反应有序进行，也实现了物质、能量和信号之间的转导。其中，药物作用靶向位点、细胞之间的信号传递以及对外界环境的探测等功能大部分依靠膜蛋白(membrane proteins，MPs)来完成。在已完成的基因测序中，约 30% 的基因编码膜蛋白(MPs)，并且在许多生理过程中发挥着重要作用，膜蛋白的重要性不言而喻。

但目前对膜蛋白的研究仍然是一个重大挑战。这一挑战集中在需要破坏磷脂双层，以促进目标膜蛋白或蛋白质复合物与所有其他蛋白质的分离。膜的破坏本身并不是一个挑战，因为有许多试剂（通常是表面活性剂或去垢剂）可以裂解膜。然而，人们早就知道，膜蛋白的亲脂性意味着从蛋白质周围完全去除膜通常会使其不能很好折叠且丧失活性。长期以来，这个难题一直挑战着生化界，尽管所有转录蛋白中有>30%是膜蛋白，但只有2%的高分辨率结构是膜蛋白¹。

自从发现膜蛋白作为一个独特的亚类以来，大多数分离它们的方法都依赖于使用去垢剂。简单来说，去垢剂为膜蛋白提供了另一种溶解环境，与磷脂膜不同，是一种不是连续体的环境，而是含有单个膜蛋白的胶束颗粒溶液。但是，这种方法存在许多基本问题。比如单纯使用去垢剂忽略了考虑膜环境的物理化学复杂性及其在维持蛋白质结构和活性方面的重要性，即使是由单一脂质组成的简单磷脂膜也包含许多在膜小叶内运作的不同环境。在含有混合脂质的膜中，这将变得更加复杂，其中不同脂质类型之间的界面提供了更多新的独特的环境。并且越来越清楚的是，膜的结构是适应于非常特定的脂质环境的，在这种环境中可以提供最佳的蛋白质折叠形式，从而使蛋白具有活性。鉴于这种生物复杂性，使用单一去垢剂将永远无法有效地复制天然脂质环境，因此始终是次优解决方案。而且去垢剂提取方法的实验本质上是“开放式”实验，需要尝试无限数量的去垢剂组合。去垢剂溶解的膜蛋白通常本质上不稳定，“保质期”非常短。且去垢剂本身的存在也经常影响下游实验。例如，膜蛋白复合物中亚基之间的相互作用通常因去垢剂的存在而受到干扰或消除²。此外，去垢剂的存在会破坏光谱技术，使区分蛋白质和去垢剂信号成为一项艰巨的任务。

在1990年代后期，几个研究小组意识到，需要在去垢剂之外寻找能使膜蛋白保持其自然生理环境的更好的提取方法。这些新方法允许将蛋白质与周围的脂质一起提取。这种方法的早期先驱是Sligar³，他表明两亲性多肽可用于稳定含有脂质双层的纳米级圆盘状结构。该方法提供了一种稳定膜蛋白的替代途径，该方法允许对封闭的双层膜中的任何蛋白质进行生物物理分析，具有接近天然的蛋白质构象。这表明膜蛋白可以用完整的脂质双层进行分离，然而这种方法并没有提供完美的解决方案，因为还是要求在插入新的含脂质纳米颗粒之前将蛋白质预先溶解于去垢剂中。

2009年，研究显示一种简单的有机聚合物（SMA（styrene maleic acid）共聚物：图 1a）可用于将蛋白质从膜直接提取到 SMALP（SMA lipid particles）中⁴，这项工作建立在Tighe早期工作的基础上⁵。这也许是第一次提供了一种通用的方法，该方法可以在不需要去垢剂的情况下提取活性膜蛋白。通过对浑浊初始溶液澄清的简单观察，可以明确地表明SMALP的形成（图1b）。SMALP包含由SMA聚合物的外环支撑的中央脂质双层（图 1c）。通过在双层的酰基链之间插入疏水性苯乙烯基团来稳定结构，而亲水性的马来酸基团则面向溶剂（图 1d）。研究还表明，封装的双层膜保留了原始细胞膜的许多物理特性，包括脂质混合物⁶，结构组织和相行为⁷。目前为止，很多工作一起表明该方法可以成功地用于提取具有多达 36 个跨膜螺旋的蛋白质。这些研究包括 AcrB、ABC 转运蛋白 PgP、钾通道 KcsA、青霉素结合蛋白 PBP2A以及腺苷 A_2A 受体的提取。重要的是，这些研究还表明，提取的蛋白质仍保持活性，与去垢剂分离方法相比，PgP 和 AcrB 在 SMALP 支架内显示出更大的活性。作为这些研究的一部分，研究者还表明，SMALP包裹的蛋白质适合使用一系列技术进行研究，包括圆二色谱 (CD)、分析超速离心 (AUC)、差示扫描量热法、负染和冷冻透射电镜以及小角度中子散射等，都证明了该方法的普遍效用。

图 1: 脂质中苯乙烯马来酸(SMA)共聚物的产生和SMALP的形成

SMALP 方法虽然解决了许多历史上困扰基于去垢剂提取系统的问题，比如无法保留蛋白质周围的天然膜环境、样品稳定性降低、效果差、干扰表征方法和成本高等等。然而，SMALP方法仍然具有很多自身局限性。第一个是提取的蛋白质的大小。构成该方法基础的圆盘状纳米粒子的最大直径接近 15 nm，对应于小于～400 kDa 的分子质量。这意味着太大的蛋白质不太可能成功。第二个重要的考虑因素是蛋白质适合的pH 值。SMA 聚合物仅在 pH 6.5 以上形成 SMALP（低于此值 SMA 不溶于水），这意味着必须在 pH 6.5 以上，最好在 pH 7.0 以上对 SMALP 形式的蛋白质进行实验。第三个限制与离子问题有关，因为 SMA 聚合物也是二价阳离子（例如 Mg²⁺ 和 Ca²⁺）的有效螯合剂，而且螯合物也是不溶的。这意味着需要高浓度二价阳离子（例如高于 5 mM）的实验可能会导致 SMALP 中断。

来自英国伯明翰大学的Timothy R Dafforn课题组将如何用制备SMA聚合物和SMALP的具体方法总结于Nature protocols期刊上，论文名为“A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment”。文章中还展示了如何使用此 SMALP 从各种来源（包括细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和酵母）中提取各种活性蛋白质。

第一个部分是如何用苯乙烯马来酸酐共聚物制备苯乙烯马来酸共聚物。提取方法中用到的SMA 共聚物试剂中苯乙烯与马来酸的比例为 2:1。这种聚合物目前仅有酸酐前体在市场上出售。因此,需要先水解 2:1 苯乙烯马来酸酐共聚物以产生马来酸形式。聚合物的酸酐形式是一种廉价的粉末状物质，可以使用碱性水解方案将酸酐转化为酸。Protocol中描述了 25 g 干燥的SMA 2000 共聚物的生产。首先将苯乙烯马来酸酐共聚物溶解在1 M NaOH 中，并在溶液加热和回流的情况下进行反应（图 2a-c）。然后溶液在室温（20 °C；图 2d）冷却后，通过添加浓 HCl 将 pH 值降低至 <5 以沉淀 SMA 共聚物（图 2e）。为确保聚合物完全沉淀，在此阶段监测 pH 值非常重要。在此阶段优先使用 pH 试纸而不是 pH 计，因为探针很容易被残留的聚合物污染。用水洗涤沉淀物三次，然后使用离心分离。第三次洗涤结束时，将沉淀物重新悬浮在 0.6 M NaOH 中。将溶液沉淀并再次洗涤，最后再悬浮于 0.6 M NaOH 中。然后将 pH 值调节至 8。由于 pH 值调节会导致聚合物沉淀，因此该步骤可能是一个漫长的过程。最后，使用冷冻干燥机将聚合物冻干。干燥的 SMA 共聚物粉末可以在室温下无限期地储存在密封容器中。

图 2  苯乙烯-马来酸(SMA)共聚物的制备

第二个部分是关于如何使用共聚物制备 SMA 脂质颗粒。当将 SMA 共聚物添加到脂质悬浮液中时，溶液从浑浊变为透明（图1b）。SMA 与脂质双层相互作用，自组装成 SMALP（图 1c）。

第三个部分是在SMALP 中膜蛋白从膜上分离。这篇文章中以在大肠杆菌中过表达的膜蛋白的纯化为例进行了详细说明，但相同的方案可用于其他表达系统，如昆虫细胞、哺乳动物细胞和酵母。与任何蛋白质纯化一样，将亲和标签添加到蛋白质的空间可及部分以确保目标与亲和树脂的最佳结合至关重要。因此，建议将亲和标签插入远离预测的跨膜区域。从膜中提取蛋白质并封装在 SMALP 中后，它们可以像任何球状蛋白质一样进行纯化。SMALP 与多种缓冲液兼容。通常使用 50 mM Tris 和150 mM NaCl，pH 8.0，或50 mM 磷酸钾或磷酸钠和 150 mM NaCl，pH 8.0 的简单溶液作为最终纯化和储存缓冲液（Tris 缓冲液或 PBS）。然而，如前所述，缓冲液应高于 pH 7.0 且不含二价阳离子（例如 Mg²⁺ 和 Ca²⁺），因为它们会干扰 SMALP 的形成并导致 SMA 沉淀。每 10 g 膜（湿重）需要约 1 g SMA。例如，通过估计膜的湿重来计算要使用的 SMA 的量：通常将膜重悬于 20 至 40 mg ml^-1 的缓冲液中，并添加 2.5%（wt/vol）的聚合物。此时不将样品放在冰上，因为这会降低膜的流动性，从而防止 SMA 从脂质环境中分离蛋白质。这与使用去垢剂纯化膜蛋白的方法有很大的不同。

图 3  利用SMA从膜中形成SMALP

第四步是关于被包裹在 SMALP 中的His标记蛋白的纯化。在开发 SMALP 蛋白质的亲和层析分离策略期间，必须考虑许多参数。其中最重要的是树脂选择和结合机制。当要用多组氨酸标签纯化 SMALP 蛋白时，树脂的选择会对蛋白纯化产生重大影响。特别重要的是选择与树脂结合的金属（镍或钴）。因此，建议进行初步的小规模结合试验，以确定哪种结合最适合被纯化的蛋白质。第二个优化选择涉及用于将蛋白质应用于树脂的结合方案。SMALP 蛋白与树脂的结合可能较弱和/或较慢；因此，允许 SMALP 蛋白与树脂孵育过夜或在 4°C 下温和孵育至少 2 小时的缓慢“分批”方法可能是最佳的。在某些情况下，观察到蛋白与树脂的结合非常紧密，这意味着可以使用更传统的柱形式结合步骤。研究者还发现 SMALP 上相对较高的负电荷会导致与树脂的非特异性结合，可以通过使用至少包含 500 mM NaCl 且在某些情况下高达 1 M NaCl 的亲和层析缓冲液来缓解。

第五步是关于如何利用SDS-PAGE分析和估计蛋白质浓度。通常，SDS-PAGE 是评估纯度的主要手段，而许多方法可用于确定蛋白质的量。对于 SMALP 中的蛋白质，SDS–PAGE 仍然是首选方法，与使用可溶性蛋白质不同的唯一变化是存在低分子量“条带”，为了确认蛋白质的身份，建议进行western，或者可以从 SDS–PAGE胶中切下蛋白质，用于质谱分析。含有游离 SMA 聚合物和/或脂质的溶液会干扰传统的蛋白质浓度估计方法。例如，游离聚合物在 280 nm 处具有较小但显着的吸光度，因此会干扰蛋白质的紫外检测方法。同样，SMA 和脂质会干扰基于染料的测定，包括 Bradford 测定。然而，当从溶液中去除游离 SMA 和脂质时，可以使用 280 nm 紫外检测方法对纯化的 SMALP 蛋白进行浓度估计。

图 4  SMALP蛋白的纯化及生物学特性研究

综上，尽管膜蛋白非常重要，但对这些蛋白的结构和功能研究仍面临重大挑战。一个重要的障碍就是从天然脂质膜中提取具有功能的蛋白。大家一般都通过使用去垢剂来实现，但这个过程昂贵且耗时，且不能保留蛋白的生理环境。本篇protocol描述了SMA共聚物的制备，以从原核和真核表达系统中提取膜蛋白。如何将膜蛋白分离到SMA脂质颗粒（SMALP）中，使这些蛋白与SMA包围的天然脂质包裹在一起。研究者在文章的Materials中详述了各个部部分的实验细节，为那些想要使用SMALP研究膜蛋白的人提供了一个实用的参考内容。大家可以在用去垢剂提取膜蛋白遇到困难时，用SMA提取的方法来试一试。

原文链接

https://www.nature.com/articles/nprot.

2016.070

参考文献

参考文献

[1] Arinaminpathy, Y., Khurana, E., Engelman, D.M. & Gerstein, M.B. Computational analysis of membrane proteins: the largest class of drug targets. Drug Discov. Today 14, 1130–1135 (2009).

[2] Breyton, C., Tribet, C., Olive, J., Dubacq, J.P. & Popot, J.L. Dimer to monomer conversion of the cytochrome b6 f complex. Causes and consequences. J. Biol. Chem. 272, 21892–21900 (1997).

[3] Denisov, I.G., Grinkova, Y.V., Lazarides, A.A. & Sligar, S.G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer nanodiscs with controlled size. J. Am. Chem. Soc. 126, 3477–3487 (2004).

[4] Knowles, T.J. et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131, 7484–7485 (2009).

[5] Tonge, S.R. & Tighe, B.J. Responsive hydrophobically associating polymers: a review of structure and properties. Adv. Drug Deliv. Rev. 53, 109–122 (2001).

[6] Scheidelaar, S. et al. Molecular model for the solubilization of membranes into nanodisks by styrene maleic acid copolymers. Biophys. J. 108, 279–290 (2015).

[7] Jamshad, M. et al. Structural analysis of a nanoparticle containing a lipid bilayer used for detergent-free extraction of membrane proteins. Nano Res. 8, 774–789 (2014).

供稿 | 谭佳鑫

审稿 | 肖媛

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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