Nature | 细胞死亡的终点：质膜破裂——NINJ1介导的“告别仪式”

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真核细胞可以经历不同形式的程序性细胞死亡，它们大多以质膜的破裂告终，并将其定义为细胞死亡的终端事件。长期以来，质膜破裂被认为是由渗透压导致的。然而近期的研究表明，在多数情况下，这是由名为ninjurin-1（NINJ1）的蛋白介导的主动过程¹。超高分辨率显微镜揭示了NINJ1会在正在死亡的细胞质膜聚集形成结构多样的组装类型，尤其是大的具有分枝形态的细丝状组装物。

2023年5月17日，瑞士巴塞尔大学的Sebastian Hiller和洛桑大学的Petr Broz，以及德国斯图加特大学的Kristyna Pluhackova作为共同通讯作者，在Nature上发表了题为“Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death”的文章，该研究解析了NINJ1蛋白组装形成的细丝状聚合物结构。其冷冻电镜结构展示出紧密排列的栅栏状的跨膜α螺旋排布，细丝的取向性和稳定性由两个连接相邻细丝亚单元的两亲性α螺旋决定。NINJ1细丝具有亲水侧和疏水侧，分子动力学模拟表示它能够稳定地覆盖在膜的边缘。该研究的数据表明，在细胞裂解死亡时，NINJ1的胞外α螺旋插入到质膜中，随后寡聚NINJ1单体形成两亲性的细丝并使质膜破裂。膜蛋白NINJ1因此作为真核生物细胞膜互作的组分，在响应细胞死亡的激活时发挥着内置断点的作用。

NINJ1是一个16-kDa的质膜蛋白，其进化保守，并存在于所有高等真核生物中。在炎症小体驱使的细胞焦亡过程中，细胞死亡执行蛋白gasdermin D（GSDMD）经过caspase依赖的切割活化，随后由NINJ1 引起下游的质膜破裂^{2, 3}。质膜破裂伴随着NINJ1的高阶寡聚以及膜泡的形成。为了更好地探究这些生物学事件的关系以及NINJ1寡聚体在响应炎症小体活化时的组装动力学，本研究在小鼠骨髓源巨噬细胞中进行了交联实验。

图1 质膜蛋白NINJ1的寡聚动力学

如图1所示，在尼日利亚菌素诱导炎症小体活化十分钟后，研究者检测到了NINJ1二聚体和三聚体的形成。在随后的时间点，NINJ1大量寡聚并形成了大分子量的聚合物。大量NINJ1的聚集伴随着切割的GSDMD p30的完全寡聚——即GSDMD孔洞的形成，这与在GSDMD活化的下游激活NINJ1相一致。此外，乳酸脱氢酶（LDH）由于过大而无法直接通过GSDMD形成的孔释放^{4, 5}，在此用于定量NINJ1介导的质膜破裂的情况。值得注意的是，炎症小体活化后，LDH的释放量随着时间的推移缓慢增加，而NINJ1的寡聚在LDH开始释放时便已可以被检测到，并且在后续的时间点只有略微的增加。在活细胞中，也可以检测到少量的NINJ1二聚体，意味着高阶的NINJ1聚合物具有活性。因此，这些时间分辨的数据与NINJ1寡聚对于质膜破裂的必要性完全一致。

随后，研究者利用随机光学重建显微技术从纳米级别研究了焦亡细胞中的NINJ1组装。活细胞呈现出均匀分布的NINJ1小点（可能是单个的分子或者小的聚合物），以及少量小的且多为圆形的簇。细胞焦亡时，会形成大的NINJ1簇，直径达500纳米至几微米。这些簇高度分枝，单个分枝向不同的方向伸出（图2）。

图2 NINJ1组装的超高分辨率成像

为了从原子水平表征NINJ1的寡聚状态，本研究在大肠杆菌中重组表达了全长的人源NINJ1，并用去垢剂n-dodecyl-β-d-maltopyranoside（DDM）将其提取出来。纯化的蛋白在负染和冷冻电镜下可以看到长的细丝状结构，其具有不同程度的弯曲，有时会闭合形成环状（图3a）。定量分析纯化的hNINJ1细丝质量后得出，其平均分子质量大约为1.3-MDa。

这种细丝由亚单元线性堆叠形成，亚单元间隔为20.95 Å，每个亚单元有–1.05°的轻微旋转。hNINJ1的前38个氨基酸仍然是无序的，与AlphaFold预测以及先前的NMR实验结果一致。的确如此，截短实验发现这些氨基酸对于hNINJ1细丝的形成无关紧要。随后的103个氨基酸（39-141）在图中具有很好的展示，可以被明确地建模为四个α螺旋α1-4。两个反向平行的α3和α4（分别为第79-103位氨基酸和第114-138位氨基酸）形成了细丝的核心（图3c）。这些螺旋具有疏水性，在蛋白非活性状态下形成跨膜螺旋的发夹结构。N端的两个螺旋α1和α2（分别为氨基酸44-55和58-74）被L56处的纽结分开。α2采取了平行于α3和α4的走向，而α1以近90°从螺旋束伸出，并与相邻的原体通过大的寡聚界面相连。其分子间接触包括一个原体的α1螺旋和相邻原体的α1，α3及α4螺旋之间多个侧链的相互作用，其中高度保守的氨基酸K45和D53形成的盐桥最为显著。互作还包括分子内接触，由α2螺旋一个大的疏水区域与α3螺旋的一段互补侧链匹配形成。最终，α3上的疏水残基与相邻原体α4的一段互补序列对齐，其中可能包括K65和F135之间的阳离子-π相互作用（图3b-c）。

图3 NINJ1细丝的冷冻电镜结构

分析NINJ1细丝的表面疏水性发现，其一侧具有亲水性，而另一侧具有疏水性。这种特性直接解释了两个hNINJ1如何通过他们的疏水面堆叠在一起并形成可溶的双细丝。这种一侧疏水一侧亲水的拓扑结构是打孔蛋白的典型特征，如gasdermins，perforin以及细菌毒素。随后，研究者测试了NINJ1增加脂质体膜通透性的能力。与NINJ1引起膜破裂的猜想一致，NINJ1蛋白脂质体的相对通透性随着hNINJ1相对于脂质的比例增加而增加（图3e）。

图4 NINJ1功能验证

随后如图4所示，本研究设计了14个单氨基酸突变，并测试其对hNINJ1在体外形成细丝以及在小鼠细胞过表达NINJ1（mNINJ1）对细胞裂解的影响。其中，8个突变设计在分子间界面(K44Q、K45Q、A47L、D53A、G95L、T123L、I134F和A138L)，2个在分子内界面(I84F和Q91A)，它们可能破坏细丝结构。4个突变设计在膜疏水界面(V82F、V82W、L121F和L121W)，以适配NINJ1寡聚。10个用于破坏细丝形成的突变中的8个（K45Q, D53A, I84F, Q91A, G95L, T123L, I134F和A138L）在HEK293T细胞中过表达时减少或完全阻止了细胞裂解，并在体外相应地表现出细丝形成减少。维持疏水界面疏水性的4个突变(V82W、V82F、L121F和L121W)对体外细丝形成的影响并未达到预期。总而言之，体外和基于细胞的突变实验结果与冷冻电镜结构以及预期的NINJ1细丝在膜边缘的功能排布完全一致。

图5 NINJ1介导的质膜破裂机制

结合超高分辨率显微镜、冷冻电镜、突变分析以及分子动力学模拟结果，本研究提出了一个NINJ1介导的膜破裂的原子模型（图5）。在活细胞中，NINJ1以单体的形式存在于细胞膜，其α1和α2螺旋在胞外侧，α3和α4螺旋插入膜中。细胞死亡发生时，两亲性螺旋α1和α2插入膜中形成纽结状构象，连接相邻原体以形成大的寡聚体。所组装的更大的寡聚体通过覆盖在膜边缘促进膜破裂，从而稳定破损处大小和形态各异的膜，使得LDH、“大的损伤相关的分子模式”（danger-associated molecular patterns，DAMPs）以及其他细胞内容物释放到胞外环境。尽管单个细丝可能足以损伤膜，但响应渗透压时，NINJ1形成双细丝并以类似拉链的方式破膜似乎更可靠。

目前，触发NINJ1从非活性状态转变为活性状态的条件依旧未知。文章所提出的寡聚机制给出了一个有趣的可能性，即膜组分至少贡献了部分的活化信号。细胞死亡时，带负电的磷脂酰丝氨酸暴露在细胞表面，这可能会被NINJ1的α1和α2螺旋所识别。的确如此，脂质结合实验发现，一个α1和α2螺旋相关的肽段可以特异性地与含有POPS的膜互作，且分子动力学模拟具有同样的效果。因此，膜组分响应作为NINJ1活化的潜在机制有望成为未来工作的方向。

总之，活化的NINJ1以独特的长的α螺旋状细丝结构覆盖在膜边缘，其导致的膜开口或破损大小各异。与ASC、NLRP3以及caspase-1的PYD和CARD结构域的可溶细丝一起，NINJ1代表着焦亡通路中另一种细丝的存在，它诠释了细胞裂解巧妙的生物物理机制，其结构为癌症、感染和炎症疾病的治疗后干预开启了新思路。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-023-05991-z

参考文献

参考文献

1. Kayagaki, N. et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature 591, 131-136 (2021).

2.Kayagaki, N. et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature 526, 666-671 (2015).

3.Shi, J. et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526, 660–665 (2015).

4.Evavold, C. L. et al. The pore-forming protein gasdermin D regulates interleukin-1 secretion from living macrophages. Immunity 48, 35–44.e6 (2018).

5.Xia, S. et al. Gasdermin D pore structure reveals preferential release of mature interleukin-1. Nature 593, 607–611 (2021).

供稿 | 张颖

审稿 | 田露

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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