Nature｜内质网“清道夫”：介导ER-phagy的泛素化异源二聚体复合物

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通常来说，大多参与内质网膜形态重塑的蛋白都具备一个共同的结构域——RHD (reticulon homology domain)，FAM134B便是其中的一个例子，该蛋白能够结合LC3，通过选择性的自噬 (ER-phagy) 降解ER sheet (图1)¹。

图1. FAM134B介导的ER-phagy以及FAM134B功能异常时神经退行性疾病发生的机制²

2023年5月24日，来自德国Friedrich Schiller University的Christian A. Hübner和来自Goethe University School of Medicine的Ivan Dikić在Nature上共同通讯，发表了一篇题为Heterometric clusters of ubiquitinated ER-shaping proteins drive ER-phagy 的科研论文。该研究发现，一种除FAM134B之外的内质网形态重塑蛋白——ARL6IP1，能够与FAM134B形成相互作用，形成异源的多蛋白复合物，进而参与ER-phagy的发生。

在过去的研究中，该研究团队已经发现FAM134B功能缺失突变的患者存在常染色体隐性的遗传性感觉和自主神经病 (hereditary sensory and autonomic neuropathy, HSAN)，临床上，患者常表现出麻木和痛觉缺失的表型³。进一步研究发现，FAM134B含有的RHD在许多与类似的神经退行性疾病相关的蛋白中广泛存在⁴。

在对一名SPG61患者的成纤维细胞进行研究的过程中，研究者发现该患者携带ARL6IP1 c.577-580delAAAC的纯和突变 (NM_015161.3; K193Ffs变体)，患者细胞中缺乏ARL6IP1的转录本。该框移突变可能导致C端的11个氨基酸残基被另外的36个氨基酸残基所替代，从而导致蛋白被降解。与野生型小鼠相比，Arl6ip1敲除鼠大脑重量明显变轻，皮层神经元和浦肯野细胞数量减少，小鼠出现肌张力降低的表型，敲除鼠的脊髓运动神经元在电生理水平也出现了明显的变化。除此之外，研究者还观察到，小鼠的外周神经元轴突肿胀，其中充斥着功能紊乱的细胞器和管状纤维样的结构，ER sheet出现明显的扩张 (图2)。

图2. Arl6ip1敲除小鼠出现神经退行性疾病表型，ER sheet扩张

ARL6IP1具有类似于FAM134B的RHD样的结构元件，其两个长的疏水区被一段linker隔开，形成发夹结构，N端和C端都朝向胞。在体外实验中，ARL6IP1能够结合脂质体，且对小脂质体的形成具有促进作用。虽然ARL6IP1被推测具备能与LC3相互作用的区域，但实验证实它并不能像FAM134B一样与LC3结合 (图3)，提示其本身单独存在时不能作为ER-phagy的受体。

图3. FAM134B与ARL6IP1相互作用

然而，在后续的酵母双杂和蛋白组分析中，ARL6IP1都被证实能与FAM134B发生相互作用，提示前者可能通过与FAM134B的相互作用间接地参与到ER-phagy当中。随后，研究者也使用免疫共沉淀、荧光共定位、BiCAP (biomolecular complementation affinity purification) 和质谱等方法对二者之间的相互作用进行了进一步的验证。在质谱分析中，ARL6IP1同源二聚体和FAM134B同源二聚体被发现与泛素化降解相关的蛋白存在相互作用，而ARL6IP1-FAM134B异源二聚体则与自噬囊泡形成相关的蛋白存在相互作用 (图4)。

图4. ARL6IP1参与形成多受体复合物，其中包含FAM134B和多种内质网形态重塑蛋白

鉴于E3泛素连接酶AMFR参与介导FAM134B的泛素化，且AMFR存在于FAM134B-ARL6IP1的互作组中，研究者进一步推测FAM134B的泛素化或许是调节其与ARL6IP1相互作用的一种机制。质谱结果提示ARL6IP1和FAM134B存在多个泛素化的Lys，这些Lys主要集中在ARL6IP1和FAM134B的RHD附近 (图5)，其中ARL6IP1 K96的泛素化程度最高。在分子动力学模拟中，泛素化的ARL6IP1呈现出更为紧凑的构象，而泛素化位点的突变会导致ARL6IP1与FAM134B之间的相互作用减弱。此外，在体外实验中，共表达AMFR可以显著增强ARL6IP1与FAM134B之间的相互作用。至此，研究者推测，ARL6IP1和FAM134B RHD区域被AMFR泛素化可能在ER-phagy相关的膜重塑中发挥重要的作用。

图5.LC3B与FAM134B-ARL6IP1的结合与ARL6IP1的泛素化相关

为进一步探究在ARL6IP1缺乏的情况下，FAM134B介导的ER-phagy是否会受到影响，研究者在野生型和Arl6ip1敲除的MEF中分别过表达mCherry-GFP-FAM134B，并通过LC3B染色对自噬体和自噬溶酶体进行定量分析 (在自噬溶酶体的酸性环境中，GFP荧光信号会发生淬灭)。结果提示，在Arl6ip1敲除的MEF中，自噬体和自噬溶酶体数量均明显减少 (图6)，在Hela细胞中单独敲除ARL6IP1和FAM134B，抑或同时敲除两者，也能产生类似的现象，此外，这两者之间的关系也在其他的一些实验中被辅证，提示FAM134B介导的ER-phagy需要ARL6IP1的参与。

图6. FAM134B介导的ER-phagy需要ARL6IP1的参与

综上所述，这项工作揭示了ARL6IP1在FAM134B介导的ER-phagy中发挥的关键作用。ARL6IP1并不能独立作为ER-phagy的受体存在，而是需要与FAM134B以及其他与ER形态重塑相关的蛋白形成复合物发挥功能，其缺失会导致ER形态和功能异常，ER-phagy受到破坏，细胞对内质网应激的适应性明显下降，此外，研究者还发现这两个蛋白的泛素化在促进二者的相互作用以及功能发挥中只管重要。ARL6IP1和FAM134B的功能缺失或异常可能会通过影响ER-phagy导致内质网中错误折叠或过剩蛋白聚积，进而影响蛋白质稳态，促进神经退行性疾病的发生。

原文链接

https://www.nature.com/articles

/s41586-023-06090-9

参考文献

参考文献

1.Khaminets, A. et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy. Nature 522, 354–358 (2015).

2.De Leonibus, Chiara et al. Beating the ER: novel insights into FAM134B function and regulation. The EMBO journal 39,5 (2020).

3.Kurth, I. et al. Mutations in FAM134B, encoding a newly identified Golgi protein, cause severe sensory and autonomic neuropathy. Nat. Genet. 41, 1179–1181 (2009).

4.Hübner, C. A. & Kurth, I. Membrane-shaping disorders: a common pathway in axon degeneration. Brain 137, 3109–3121 (2014).

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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