Nature｜反向代谢组学助力新代谢物发现与解析

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人类代谢组的注释还远未完成，典型的人类来源样本的非靶向代谢组学研究可以用结构注释约10%的数据¹。因此，目前需要新的策略来从结构上进行评估。过去人们是通过分离化合物，然后进行结构表征来发现小分子的，但这对人类样本而言并不实用。近年来，研究人员开发了几种生物分子结构解析的方法，包括单分子原子力显微镜等²，但这些方法的处理速度还不足以对高分辨率质谱仪所检测到的众多分子进行详细的结构分析。

2023年12月5日，加州大学圣地亚哥分校的Pieter C. Dorrestein教授团队在Nature上发表了题为Reverse metabolomics for the discovery of chemical structures from humans的研究性论文。该研究提出了一种反向代谢组学的新策略，即从新合成的化合物中获得MS/MS光谱，并在公共代谢组学数据中搜索以揭示表型关联。为了证实这一概念，作者广泛地合成和探索了人体多种代谢物，并发现其中一些共轭胆汁酸与炎症性肠病(IBD)有关。因此反向代谢组学可以作为发现人体或动物中新分子的通用策略。

为了补充现有的结构解析策略和丰富已知或新发现分子的生物信息，作者开发了反向代谢组学，也就是首先利用组合合成创建潜在代谢物的复杂混合物，然后获得合成混合物中化合物的串联质谱(MS/MS)数据，再与公共数据库中的质谱数据进行比较分析，从而推断出未知的代谢组组分（图1a）。为了评估反向代谢组学策略的能力，作者创建了四种代谢物类别的MS/MS：N-酰基酰胺、脂肪酸酯、胆汁酸酯和胆汁酰胺，并最终获得了2430个分子的MS/MS谱图，其中31%的谱图在人类数据中已知。基于反向代谢组学分析，作者推测微生物胆酰胺与炎症性肠病(IBD)之间存在很强的关联，并在多个IBD队列中验证了这种关联（图1b-d）。

图1. 反向代谢组学研究策略

酰基酰胺和酯是人类重要的信号分子，其结构尚未完全确定和表征。作者合成了1472种酰基酰胺和782种酰基酯类化合物，并确定了这些化合物的质谱数据，随后利用MASST工具搜索公共数据库中相匹配的代谢组学数据，并使用ReDU研究了这些化合物在公共数据中信息以及它们如何与健康表型相关联。大多数与合成酰胺和酯相匹配的化合物来自动物样本，主要来自于人类和小鼠。合成的酰胺最常在粪便、盲肠和皮肤样本中观察到，而酯在许多不同的组织类型中都能观察到（图2a-b）。

胆汁酸的结构表征历史悠久，人们最初发现胆汁酸在脂肪消化过程中起到乳化剂作用，最近发现其在调节宿主免疫反应和信号通路，以及在宿主-微生物相互作用中起关键作用³。它们以多种形式存在，包括游离羧酸、羟基共轭物和胆汁酰胺等，都对维持宿主健康至关重要。随后作者聚焦于胆汁酰胺，基于先前研究，作者推测微生物结合的胆汁酸是胆汁酰胺的一部分，并将8种二羟基和三羟基胆汁酸与22种氨基酸进行了组合酰胺偶联反应，并在公共代谢组学数据中发现了145个合成化合物的MS/MS匹配（图2c）。作者进一步研究了公共数据中不同的共轭胆汁酸结构与健康状况的关系，发现与健康受试者相比，在所有类型的IBD样本中，某些类型的共轭胆汁酸结构，特别是与Glu，Ile/Leu，Phe和Trp共轭的频率更高(图2d)。作者进一步推测。与健康对照相比，这些胆汁酸更可能在IBD患者中被发现。为了验证这一假设，作者在IBD患者和非IBD对照组的数据集中观察了新胆汁酸的相对丰度，发现克罗恩病样本中几种胆汁酸的相对峰值区域比健康对照组高(图2e)。作者还研究了这些胆汁酸的丰度在儿童IBD队列中是如何随着抗生素摄入而变化的，接受抗生素治疗的婴儿微生物来源的胆汁酸水平较低，而宿主来源的甘氨酸和牛磺酸共轭物的丰度高于未接受抗生素治疗的婴儿(图2f)。

图2. 公共质谱数据的存储库规模分析

利用纵向整合人类微生物组计划2（iHMP2）以及cross-sectional PRISM IBD队列的数据和样本，作者对这些胆汁酸与IBD之间的关联进行了独立验证。作者收集了非IBD、溃疡性结肠炎和克罗恩病患者的粪便样本，然后将粪便提取物合并，用混合胆汁酸标准品进行分析（图 3a）。作者在iHMP2 IBD数据集中观察到63种胆汁酸偶联物，其中45种具有相对量化数据，19种也在PRISM组中检测到（图 3b），并且共轭胆汁酸在克罗恩病患者中的含量更高。作者还使用了另一个单独的IBD队列，定量研究了共轭胆汁酸的丰度与克罗恩病和溃疡性结肠炎症状的关系。被量化的19种胆汁酸中有11种在有活跃症状的个体中显著升高，但仅在克罗恩病组中，溃疡性结肠炎患者没有观察到同样的趋势（图 3c）。由于观察到胆汁酸可能在IBD中发挥关键作用，作者进一步评估它们是否具有生物活性，并单独合成了在iHMP2 IBD人群中丰度最高的胆汁酸共轭物，测试它们在IBD相关途径中的活性。结果表明一些新发现的胆汁酸共轭物可以通过PXR和免疫介导的过程在IBD中发挥重要作用。

图3. 新型结合型共轭胆汁酸与IBD的关联

细菌参与了宿主衍生胆汁酸向次级胆汁酸的转化，并且作者先前的研究表明细菌能够在体外产生一些共轭胆汁酸⁴，因此作者推测儿童抗生素IBD可能是由肠道微生物群产生的。为了进一步探索这种微生物共轭化学的程度，作者从第一个人类微生物组项目中筛选了202株分离物，以检测胆汁酸共轭能力。LC-MS/MS分析表明，放线菌属、芽孢杆菌属、梭状芽胞杆菌属和梭杆菌属是主要的产生菌，同时在拟杆菌属的培养物中也发现了一些共轭胆汁酸（图 4a-c）。进一步表征共轭胆汁酸的细菌生产，作者还使用了LC耦合离子迁移谱-质谱法，在培养提取物中观察到18种氨基酸共轭（图 4d-e）。

图4. 在含有胆酸和去氧胆酸的粪便培养基中培养的HMP分离物中观察到胆汁酸共轭

综上所述，该研究发展了一种通过组合合成某一类化合物从而在代谢组数据集中发现和解析人体内代谢物结构的反向代谢组学的方法，并将新发现的胆汁酸与疾病表型联系起来，这可能最终具有准确和非侵入性检测克罗恩病的诊断价值。

供稿 | 娄鑫垚

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06906-8

参考文献

参考文献

1. Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P. & Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nat. Rev. Chem. 1, 1–20 (2017).

2. Iwata, K. et al. Chemical structure imaging of a single molecule by atomic force microscopy at room temperature. Nat. Commun. 6, 7766 (2015).

3. Wahlström, A., Sayin, S. I., Marschall, H.-U. & Bäckhed, F. Intestinal Crosstalk between Bile Acids and Microbiota and Its Impact on Host Metabolism. Cell Metab. 24, 41–50 (2016).

4. Quinn, R. A. et al. Global chemical effects of the microbiome include new bile-acid

conjugations. Nature 579, 123–129 (2020).

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