Cell | RNA糖基化？还要上膜？它究竟要做什么？

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在我们普遍的认知中，RNA总在细胞核或细胞质中发挥功能，即便其在细胞膜上出现，也会被认为仅与细胞膜存在较弱的、不稳定的相互作用。然而，在2020年，研究者发现人单核细胞的细胞膜上的确存在RNA，且相应的寡核苷酸片段拮抗RNA的功能后，会影响单核细胞与内皮之间的黏附¹。

图1. RNA与单核细胞表面marker存在共定位¹

在2021年，来自Harvard的Carolyn R. Bertozzi团队发现癌细胞系和胚胎干细胞表面的一些microRNA存在N-糖基化的现象，并将这类RNA命名为glycoRNA，其糖基化的发生与几种导致蛋白糖基化的酶相关²。

GlycoRNA作为一个新兴的研究领域，其产生的具体机制和在体水平的生理作用很大程度上仍旧未知。2024年1月22日，来自耶鲁大学的卢俊教授和吴殿青教授在Cell上发表了题为“Cell surface RNAs control neutrophil recruitment”的科研论文。这项工作以中性粒细胞为研究对象，发现其表面的glycoRNA会影响其与内皮细胞之间的黏附，从而影响其向炎症部位的趋化运动。同时，研究者还发现，glycoRNA与内皮细胞上的P-选择素 (P-selectin, Selp) 相互作用，由细胞内产生，并经由Sidt被转运到细胞表面。

研究者先利用Bertozzi团队于2021年报道过的方法验证永生化的髓系细胞 (HOXB8)、由该髓系细胞分化而来的中性粒细胞、以及小鼠原代中性粒细胞表面是否存在glycoRNA2。简单来说，研究者先用Ac4ManNAz对糖基进行标记，在提取细胞总RNA后，利用DBCO-PEG4-Biotin标记Ac4ManNAz的叠氮基团，通过检测生物素信号，从而确定glycoRNA的存在 (图2, 左侧)。结果发现在三种细胞中都有生物素信号存在，且该信号对RNaseA敏感 (图2, 右侧)。进一步实验发现，在不破坏细胞膜的情况下，RNaseA的处理也会导致生物素信号消失，且对其进行染色时，发现信号主要存在于细胞表面，进一步验证了glycoRNA的细胞膜定位。

图2. 中性粒细胞表面存在glycoRNA

那么，中性粒细胞表面的glycoRNA是否影响其在体内的生物学功能呢？通常，在体内炎症发生时，中性粒细胞会被募集到炎症发生部位，经历在血管内皮细胞表面的滚动、黏附、侵袭等一系列过程到达炎症部位。研究者在利用巯基乙二醇酸盐 (thioglycolate, TG) 诱导小鼠腹膜炎模型后，向其血液中以1:1的比例注射了经RNaseA处理 (红色荧光) 和未经RNaseA处理 (绿色荧光) 的中性粒细胞，在2.5小时后，利用流式细胞术检测到达腹膜处两种细胞的比例。结果发现，经RNaseA处理后的细胞到达腹膜炎部位的比例明显降低 (图3)。

图3. 去除细胞表面的glycoRNA影响中性粒细胞向炎症部位的迁移

在利用Transwell实验进行验证时，研究者发现，RNaseA去除细胞表面glycoRNA后，在趋化信号fMLP的刺激下，中性粒细胞穿过内皮细胞向下层迁移的能力明显减弱 (图4A)。而在体实验中，通过向小鼠颈动脉注射RNaseA处理的中性粒细胞和模拟处理的中性粒细胞混合物，并在提睾肌处的血管检测两种细胞的荧光信号，发现RNaseA处理后，中细粒细胞在内皮细胞上由自由流动转变为滚动的比例明显降低 (图4D、4E；视频1)。

图4. 中性粒细胞的趋化运动减弱

视频1. 无glycoRNA的中性粒细胞在内皮细胞上的滚动减弱

在中性粒细胞与内皮细胞黏附的过程中，中性粒细胞表面的整合素或内皮细胞表面的选择素通常发挥着关键作用³。RNaseA的处理并未显著改变中性粒细胞表面整合素Cd11a和Cd11b的水平，也不改变其与配体ICAM-1之间的相互作用。但是用抗体封闭P-选择素后，glycoRNA与内皮细胞之间的结合部分减弱 (E-选择素未出现相应的现象) (图5)。在后续的动物实验中，Selp的敲除也会导致中性粒细胞在血管内皮细胞上的滚动减弱。

图5. P-选择素参与glycoRNA介导的中性粒细胞与内皮细胞之间的相互作用

过去针对glycoRNA的研究认为，glycoRNA是由死亡的细胞释放到细胞外环境中，进而被细胞捕获到细胞表面的 (图6, Model 1)。然而，关于这一问题，还可能有另外一种解答，即细胞表面的glycoRNA是由细胞自己合成的 (图6, Model 2)。为了阐明这一问题，研究者利用Ac₄ManNAz标记糖基，同时用绿色荧光标记细胞，而糖基无标记的细胞则予以红色荧光，并对两种细胞进行共培养。结果发现，只有在带有Ac₄ManNAz标记的、绿色荧光的细胞中才能检测到生物素信号，而携带红色荧光的细胞并未捕获到携带有相应标记的RNA，提示glycoRNA很大可能是由细胞本身产生并运送到细胞表面的 (图7)。当C. elegans RNA转运蛋白Sid-1在哺乳动物中的同源蛋白被敲出时，细胞表面glycoRNA的含量明显减少，且中性粒细胞的迁移能力明显减弱。

图6. 探究glycoRNA来源的实验设计思路

综上，本文回答了关于glycoRNA的一系列重要问题，包括它从哪里来，要发挥什么样的功能等。RNA的糖基化是对传统以蛋白质和脂质为主的糖生物学的重要补充，鉴于RNA存在形式和类型千变万化，其生物学功能当远不止于此，更多的故事细节仍有待未来的研究添砖加瓦。

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 雨萱

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原文链接

https://www.nature.com/articles/s41592-023-02087-4

参考文献

参考文献

1. Huang, N., Fan, X., Zaleta-Rivera, K., Nguyen, T.C., Zhou, J., Luo, Y., Gao, J., Fang, R.H., Yan, Z., Chen, Z.B., et al. (2020). Natural display of nuclear-encoded RNA on the cell surface and its impact on cell interaction. Genome Biol. 21, 225.

2. Flynn, R.A., Pedram, K., Malaker, S.A., Batista, P.J., Smith, B.A.H., Johnson, A.G., George, B.M., Majzoub, K., Villalta, P.W., Carette, J.E., et al. (2021). Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell 184, 3109–3124.e22.

3. Filippi, M.D. (2019). Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood 133, 2149–2158.

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