Nature：Ca2+感受受体的异构调节和G蛋白选择性

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对循环Ca²⁺水平进行严格调控是维持人体正常生理活动的一个重要环节，这在很大程度上依赖于钙离子感受受体 (calcium-sensing receptor, CaSR)。该受体可以检测血清钙离子增加，并激活G蛋白信号传导，限制甲状旁腺激素 (PTH) 的分泌，促进肾脏排钙¹。此外，人类CaSR中的数百种自然突变还导致了多种疾病，影响了全球近10%的人口²。

CaSR属于C家族GPCR，还包括γ-氨基丁酸B (GABA_B) 和代谢性谷氨酸(mGlu)受体 (mGlu1-mGlu8)。这个家族的成员表现出不同的G蛋白偶联选择性。CaSR的另一个显著特点是，它能与各种天然配体结合，包括多价阳离子如Ca²⁺、阴离子如磷酸盐、L-氨基酸、肽和多胺。在不同的生理条件下，这些配体的相对浓度变化可能促进或抑制受体的激活。CaSR作为合成的正和负变构调节剂（PAMs和NAMs）的治疗靶点，这些调节剂分别增强或抑制受体的激活。例如，西那卡塞是一种FDA批准的针对CaSR的PAM药物，用于治疗继发性甲状旁腺功能亢进和甲状旁腺癌。虽然已报道了人类CaSR与不同配体结合（包括Ca²⁺、L-色氨酸、PAMs或NAMs）的冷冻电镜结构，但其他配体如多胺的结合方式尚未被表征³。

2024年2月7日，美国斯坦福大学Georgios Skiniotis实验室在Nature期刊上发表了题为Allosteric modulation and G-protein selectivity of the Ca²⁺-sensing receptor的论文。研究者解析了在脂质纳米盘中重构的人类CaSR的cryo-EM结构，揭示了CaSR如何利用由脂质和精胺分子稳定的不对称界面在一个亚基中激活G蛋白；G_i和G_q如何与采用不同构象的受体接触；7TM PAM西那卡塞如何诱导侧链重排以促进G蛋白耦合；以及色氨酸如何在没有外源PAM的情况下与7TM捆绑结合。

研究者首先通过细胞的生物发光共振能量转移实验测定了CaSR主要激活G_i/o和G_q/11亚型。接下来，研究者在MSP1E3D1包裹的脂质纳米盘中解析了西那卡塞 (cinacalcet, CINA) 结合的活性态CaSR、CaSR-G_i复合物和CaSR-G_q复合物的结构，分辨率为2.8-3.6 Å（图1）。

图 1 脂质纳米盘中CaSR活化态和CaSR-G蛋白复合物的冷冻电镜结构

在CINA结合的CaSR-G_i和CaSR-G_q结构中，研究者观察到在受体二聚体的ECL-CRD区域之间的狭窄亲水裂缝中出现了强密度（图2a），后经质谱鉴定为精胺。对CaSR-G_i结构进一步观察还发现了位于CaSR的下部VFT叶片 (LB2) 之间的两个负电凹槽处的精胺密度（图2b）。同时突变VFT和ECL-CRD区域中所有三个精胺结合位点使精胺诱导的CaSR激活减弱（图2c）。值得注意的是，E228K、E604K和E757K是功能增强的ADH1致病突变。以上观察表明，带正电的多胺通过稳定二聚体界面的负电荷同时“拉链式”连接ECDs和7TMs来激活CaSR。

图 2 CaSR的精胺结合位点

在CaSR-G_i和CaSR-G_q结构中，7TM_GC的胞质区域与7TM_NGC差异很大。当CaSR与G_i或G_q结合后，7TM_GC中的TM3和TM4的胞质末端，以及ICL2变得有序并向下延伸至G蛋白（图3a）。这些结构变化形成了一个包括TM3、ICL1、ICL2、ICL3、H8和C端的胞内口袋，与Gα_i或Gα_q的α5螺旋发生相互作用（图3a、c、d）。

有趣的是，CaSR采用不同的ICL2构象与G_i和G_q进行相互作用（图3c、d）。在与G_i结合的单体中，ICL2形成一个向下的短α螺旋，与Gα_i的α5螺旋相互作用（图3c）。相比之下，当与G_q结合时，ICL2采用环状构象并向上移动，同时伴随着TM4的螺旋延伸（图3d）。ICL2的显著构象变化使不同的残基组合与G_i和G_q发生相互作用，表明它在决定G蛋白特异性方面起着至关重要的作用。

图 3 CasR与Gα_i和Gα_q结合时形成具有不同ICL2构象的细胞内口袋

最引人注目的是，CaSR C端对两类不同G蛋白采取相反的取向。在与G_i耦合的单体中，C端用环状构象，并在F881后朝向Gα_i Ras结构的C末端叶翻转（图4a）。相比之下，当与G_q结合时，C端形成H8延伸，并进一步延伸至Gα Ras结构的N末端叶（图4b）。一系列结构细节解释了CaSR C端如何以不同的取向与G_i和G_q发生作用。此外，CaSR的激活已被证明会刺激C端残基T888的磷酸化⁴。根据结构信息，T888的磷酸化可能会阻碍其与G_q的结合，但不会阻碍与G_i的结合，从而导致偏向性G蛋白信号传导，实验进一步验证了该假设（图4c）。

以上分析表明，CaSR对G蛋白的识别主要由ICL2和受体的C端决定，它们经历了相当大的构象变化，以适应Gα_i和Gα_q的α5螺旋和核心区域的差异。与G_i相比，在CaSR C端和G_q之间观察到的更稳定的相互作用可能部分补偿了ICL2和G_q之间缺乏强烈相互作用的情况。

图 4 CaSR C端在结合G_i和G_q时采取相反的取向

CINA在CaSR两个7TMs中采取不同的姿势，在G_i和G_q耦合的CaSR中，7TM_GC展示了一个弯曲的CINA，而7TM_NGC则包含一个延伸的CINA（图1d,e），进一步暗示了激活态CaSR中两个7TMs之间的关键结构差异。

为了解PAM诱导的构象变化和G蛋白耦合CaSR的7TM结构，研究者进一步确定了CaSR-G_i复合物的结构，在无外源PAM的情况下，分辨率为3.5 Å。有趣的是，在CaSR-G_i复合物结构的7TM_GC中还观察到色氨酸的密度。在该结构中，7TM_GC显示出TM5向外远离7TM核心的外移，这可能是由于色氨酸的结合。此外，相对于7TM_NGC，7TM_GC显示出TM6向上移动，比CINA结合的CaSR-G_i复合物中更为明显。

 图 5 在无PAM和CINA结合的CaSR-G_i复合物中的7TM调节位点

总的来说，研究者利用冷冻电镜和功能实验研究了嵌入脂质纳米盘中的人类CaSR的激活，以及在有无钙敏感药物西那卡塞的情况下与功能性G_i和G_q蛋白的耦合。高分辨率结构显示，G_i和G_q都驱动激活的CaSR二聚体发生额外的构象变化，以稳定涉及关键蛋白-脂质相互作用的七跨膜结构域 (7TM) 更广泛的不对称界面。受体通过ICL2和C端的重排实现对G_i和G_q的选择性耦合。结构还显示，天然多胺靶向CaSR的多个位点，通过在两个亚基之间拉紧负电区域来增强受体的激活。此外，研究者还发现，作为CaSR胞外结构域结合配体的L-色氨酸，占据了G蛋白偶联亚基的7TM捆绑部位，位置与西那卡塞和其他变构调节剂相同。总之，这些结果为CaSR的G蛋白激活和选择性提供了框架，以及其受内源和外源配体的变构调节。

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07055-2

参考文献

参考文献

[1] Hofer, A. M. & Brown, E. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 530–538 (2003).

[2] Massy, Z. A., Henaut, L., Larsson, T. E. & Vervloet, M. G. Calcium-sensing receptor activation in chronic kidney disease: effects beyond parathyroid hormone control. Semin. Nephrol. 34, 648–659 (2014).

[3] Ling, S. et al. Structural mechanism of cooperative activation of the human calcium-sensing receptor by Ca2+ ions and L-tryptophan. Cell Res. 31, 383–394 (2021).

[4] Bai, M. et al. Protein kinase C phosphorylation of threonine at position 888 in Ca2+o-sensing receptor (CaR) inhibits coupling to Ca2+ store release. J. Biol. Chem. 273, 21267–21275 (1998).

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