Nature|RNA舞台上的谢幕—Integrator角色揭秘
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在后生动物中,RNA聚合酶II (Pol II) 转录在启动子近端停顿时受到调控,涉及延伸因子DSIF和NELF形成的暂停延伸复合体 (PEC)1。Pol II的有效延伸需要P-TEFb激酶复合体的磷酸化作用,导致NELF解离以及SPT6和PAF1复合体 (PAF1c) 的结合。另外,PEC在与整合体 (Integrator) 和PP2A结合后也可以发生过早终止(也称为衰减)。整合体不仅在转录过程中靶向停顿Pol II,还参与终止非编码Pol II转录的合成。事实上,整合体是Pol II转录的全基因组调控因子2。
整合体是一个大约1.5MDa的复合体,最初被认为包含14个亚基,命名为INTS1–INTS14,后增加C7orf26为INTS15亚基3。整合体-PP2A复合体的结构分析揭示了其在非活性构象中,通过绑定到PEC变为活性构象。INTS4、INTS9和INTS11构成的切割模块具有内切酶活性,负责RNA的切割。其他亚基如INTS1、INTS2和INTS5-INTS8构成整合体的核心部分,参与调节PP2A对Pol II CTD的去磷酸化4。
整合体部分亚基如INTS3、INTS10、INTS12、INTS13和INTS14,由于其灵活性未能在早期结构中被解析。其中,INTS3可以与涉及DNA损伤反应的SOSS复合体结合。然而,这些灵活的整合体亚基和SOSS因素在整合体功能中的分子作用尚不清楚。
整合体依赖的Pol II终止被认为包括三个步骤:(1)整合体绑定PEC并通过PP2A反对P-TEFb激酶活性,(2)INTS11的内切酶活性切割新生RNA,以及最终(3)解开DNA-RNA杂交体。整合体如何通过这一最后步骤实现Pol II终止尚不明确。
2024年4月3日,德国马克斯普朗克研究所Patrick Cramer实验室在Nature期刊上发表了题为Structural basis of Integrator-dependent RNA polymerase II termination的论文。本项研究解析了整合体终止过程中的的三个冷冻电镜结构,提供了整合体终止Pol II动态模型的见解。
研究者解析了预终止复合物的冷冻电镜结构,该结构还揭示了先前未解决的整合体尾部模块(图1,2)。令人意外的是,研究者还发现了与整合体相互作用的已知蛋白DSS1在INTS7上结合的密度(图1a)。DSS1结合到整合体、蛋白酶体、COP9信号体、TREX2和BRCA2,并在这些复合物中发挥支架功能。在预终止复合物的结构中,只有亚单位INTS3和INTS12尚未解析。
图 1 预终止复合物和整合体活性的冷冻电镜结构
整合体结构的尾模块呈蝎子尾巴的形状,INTS15形成尾部的开始,将INTS10-INTS13-INTS14模块锚定到整合体的核心,尾部的“螫刺”由INTS13-INTS14二聚体形成。与先前报道的生物信息学和生物化学分析一致,INTS10形成了从INTS15到帮助定位尾模块螫刺的桥梁。基于结构信息,研究者还发现,尾模块的螫刺将与上游DNA和DSIF DNA夹发生冲突,因此,INTS13-INTS14二聚体将与DSIF DNA夹和上游DNA竞争并排斥它们,促进核酸从Pol II裂缝中释放,从而促进Pol II终止(图2)。
尽管尾模块通过打开DSIF夹可能促进核酸从Pol II裂缝中释放,但终止通常需要因子在正在退出的新生RNA上作用,解开DNA-RNA双链。为了调查整合子核酸酶INTS11是否也具有这样的功能,研究者进行了RNA裁剪实验。结果表明,INTS11核酸酶不仅会在正在退出的新生RNA中催化一次切割,而且还可以进一步降解新生RNA。这一观察结果与整合体在解开DNA-RNA杂交物以触发Pol II终止中的功能一致(图1c,d)。
图 2 整合体尾部模块结构
为了探究NABP2和INIP如何与整合体在Pol II暂停位点相互作用,研究者解析了整合体-PP2A-SOSS-CTD后终止复合物的结构,并包含Pol II CTD和Integrator-PP2A的密度,包括INTS3灵活亚基的N端结构域和SOSS因子,整体分辨率为3.7 Å(图3)。与预终止结构比较表明,INTS3和SOSS因子的存在与Pol II的结合是不兼容的(图3e)。这表明INTS3结合到整合体的开放构象,并阻止了Pol II在终止后重新结合到整合体。
图 3 后终止复合物的冷冻电镜结构
此外,研究者还想进一步探究在没有PEC的情况下,INTS3的N端区域是否会结合到INTS7上。他们混合了Integrator-PP2A、NABP2和INIP,解析了该复合物3.1 Å的电镜结构。结构显示整合体处于闭合状态,类似于已报道的自由Integrator-PP2A复合物的结构。
将该结构与预终止结构和后终止结构比较发现,SOSS因子在自由整合体中与INTS3结合,并由于INTS3和INTS6的灵活C端区域之间的相互作用而存在于Pol II暂停位点。整合体通过切割和破坏Pol II延伸复合物,使INTS3能够瞬时结合到位于整合体和Pol II之间的INTS7表面,以防止Pol II重新与整合体结合。总之,自由Integrator-PP2A复合物的结构表明,INTS1的N端区域在从后终止复合物中移除INTS7中的INTS3方面起着作用。这将使整合体能够采用可以打开以结合PEC的闭合构象。
图 4 自由Integrator-PP2A复合物的冷冻电镜结构
有趣的是,研究者在自由Integrator-PP2A复合物的结构中还发现了一个占据PP2A-C活性中心的肽段密度,对此密度进行建模并指定为INTS6残基626-633,也称为INTS6抑制环(图5)。INTS6抑制环中的酸性残基D629和E630结合到PP2A-C活性位点以阻碍底物结合(图5b,c)。此外,研究者还观察到预终止复合物中INTS6抑制环的密度,综合结构信息表明,INTS6对PP2A的抑制功能是保守的,确保自由Integrator-PP2A复合物中的磷酸酶处于非活性状态。
图 5 整合体亚基INTS6调控PP2A,以及整合体依赖的Pol II终止循环模型
整合体依赖的过早终止正在成为调控Pol II转录的一个重要方式,但目前对整合体如何终止Pol II的理解还很有限。在这里,研究者呈现了完整整合体的三个冷冻电镜结构:(1)一个与PEC结合在终止前状态;(2)一个与Pol II结合在终止后状态;以及(3)一个完整的自由整合体复合物结构处于非活性状态。终止前复合物的结构揭示了以前未解决的整合体尾部模块,其形状像蝎子的尾巴,包括一根“螫刺”。尾部模块与Integrator核心和切割模块结合,定位其螫刺并取代DSIF DNA夹,并干扰上游DNA。终止后的结构显示INTS3 N端区域与整合体的开放构象中的INTS7结合,并防止Pol II在终止后重新结合到整合体。最后,自由Integrator-PP2A复合物的结构显示,在没有PEC的情况下,复合物采用非活性状态,INTS1 N端区域干扰INTS3的结合,而INTS6占据PP2A-C活性位点。
本文为整合体依赖的Pol II终止提出了一个三步模型。首先,非活性的Integrator-PP2A复合物经历构象重排以打开并与PEC结合,这将PP2A磷酸酶定位,从而使Pol II CTD去磷酸化,抵消P-TEFb的激酶活性。其次,整合体尾部模块取代DSIF DNA夹和上游DNA,整合体内切酶INTS11切割新生RNA并进一步降解它以展开DNA-RNA双链并触发转录泡的坍塌,从Pol II中释放DNA。第三,Pol II从整合体中解离,INTS3和相关的SOSS因子防止其重新结合,它们与INTS7表面结合并在空间上阻止与Pol II形成复合物。最后,整合体采用封闭的非活性构象,准备进行另一个终止循环(图5e)。
供稿 | 肖媛
审核 |谭佳鑫
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲 王婧曈
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原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07269-4
参考文献
参考文献
[1] Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H. & Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II–DSIF–NELF. Nature 560, 601–606 (2018).
[2] Wagner, E. J., Tong, L. & Adelman, K. Integrator is a global promoter-proximal termination complex. Mol. Cell 83, 416–427 (2023).
[3] Replogle, J. M. et al. Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq. Cell 185, 2559–2575 (2022).
[4] Fianu, I. et al. Structural basis of Integrator-mediated transcription regulation. Science 374, 883–887 (2021).
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