Cell | CrYcf2-FtsHi——为衣藻叶绿体蛋白转运系统供能的分子马达

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叶绿体，作为进行光合作用的关键细胞器，广泛存在于陆地植物和藻类等光合生物之中。在这其中，约有3000种叶绿体蛋白质由细胞核基因编码，于细胞质内合成后以前体蛋白的形式，借助叶绿体内外膜转运蛋白（TOC-TIC）踏入叶绿体的“大门”。科学家们推测，定位于叶绿体内膜的分子马达能够水解ATP，犹如强劲的引擎，驱动着前体蛋白顺利通过TOC-TIC膜转运蛋白。

图1 莱茵衣藻叶绿体蛋白转入系统的结构模型

Ycf2-FtsHi复合物，恰似一位得力的“搬运工”，可直接与各种易位前体蛋白相互作用，被确认为叶绿体转入系统的分子马达。在陆地植物里，比如拟南芥和烟草，Ycf2-FtsHi精心构筑起一个2MD的超复合物，这个超复合物就像是一座精密的“分子大厦”，由最大的叶绿体编码蛋白Ycf2、五种核编码的类FtsH蛋白（FtsHi1、FtsHi2、FtsHi4、FtsHi5和FtsH12）以及一种质体NAD-苹果酸脱氢酶（pdNAD-MDH）共同组成。然而，绿藻中的Ycf2-FtsHi复合物却犹如蒙着一层神秘的面纱，其详细组成仍不甚清晰。并且，陆地植物中Ycf2-FtsHi复合物的一些成分，如FtsH12，在衣藻中很可能消失不见，这无疑表明陆地植物和绿藻类物种之间的马达复合物在组成上存在着显著差异。

继前期成功解析莱茵衣藻TOC-TIC超大复合物结构之后，2024年8月2日，来自西湖大学的闫浈课题组在《细胞》杂志上发表了一篇题为 “Conservation and specialization of the Ycf2-FtsHi chloroplast protein import motor in green algae”的研究文章。该研究巧妙地运用基因编辑和冷冻电镜技术，如同开启了微观世界的“探秘之钥”，成功分离并解析了莱茵衣藻天然Ycf2-FtsHi复合物，其整体分辨率达到了2.8-2.9Å。

图2 基于CRISPR-Knock In的Ycf2-FtsHi复合物原位纯化

为了验证衣藻中Ycf2-FtsHi复合物的存在并深入探究其组成部分，研究人员通过基因编辑在Fhl1和Fhl3基因位点的C末端引入一个3x FLAG标签，获得了Fhl1-KI和Fhl3-KI两种敲入型藻株。由这两种藻株纯化而来的样品，在分子筛中呈现出相似的图谱；在SDS-PAGE上也显示出类似的条带模式，有力地表明两种标记方法都成功分离出了相同的蛋白质复合物。此外，研究人员从质谱结果中新鉴定到两种含有AAA+ATPase结构域的蛋白质，即Ctap1和Ctap6。

图3 Ycf2-FtsHi复合物的分子结构

随后，研究人员使用来自Fhl1-KI藻株的样本进行了三种不同条件下复合物的冷冻电镜解析，即：apo (空载)、ATP-bound和AMPPNP-bound（不可水解的ATP类似物）。解析结果确定了19个亚基。其中，五个马达组件Ycf2、Fhl1、Fhl3、Ctap1和Ctap6在叶绿体基质中组装成异源多聚体马达模块；剩下的14个与马达组件相关的辅助成分，包括3种基质内蛋白、4种膜间隙蛋白以及7种跨膜蛋白。

图4 衣藻 Ycf2-FtsHi马达模块的整体结构

衣藻Ycf2-FtsHi的马达模块是一个异六聚体复合物，包含五个组件，其中Fhl3有两份“拷贝”。与其他四个组件相比，Ycf2独具大量特殊的结构片段，包括定位于在ATPase结构域内的insertion A和蛋白酶结构域内的insertion P。与传统的AAA+蛋白酶相比，这些片段占据了马达模块的中央腔，导致ATP酶和蛋白酶结构域环之间的距离变大，并且在侧向开启了一个口子。另外，所有马达组件的蛋白酶结构域都缺少一个对于蛋白质降解至关重要的锌结合HEXXH motif。由此可见，CrYcf2-FtsHi的马达模块似乎更倾向于行使蛋白质转运而非蛋白质降解的功能。

图5 马达模块发挥ATPase的活性

研究人员基于AMPPNP-bound的密度图谱来分析马达模块的ATPase活性，发现有4个AMPPNP分子分别结合在Fhl3-A、Ctap1、Ctap6和Fhl1上，遵循一种保守的结合模式，即Walker A和Walker B motif协调结合磷酸基团。值得注意的是，在Fhl3-B和Ycf2中没有发现AMPPNP的结合密度。Fhl3-B与Fhl3-A共享同一个ATP结合位点，或许保留着结合ATP的能力。但Ycf2中的Walker A motif并不保守，loop区更长，就像一道“分子屏障”，可能会阻碍ATP的靠近。

图6 CrYcf2-FtsHi与 CrTOC-TIC结构上的潜在联系

为了探索CrYcf2-FtsHi与CrTOC-TIC之间的可能联系，研究人员整合了两种复合物的结构数据。从形状和电荷层面上看，两者的接触界面完美地互补在了一起，并且围绕着CrTOC-TIC的膜间隙裂口区，该区域被认为是前体蛋白在膜间隙转运的通道。此外，Ycf2-FtsHi复合物的马达模块倾斜45度角，精确定位于TIC复合物的Tic20下方，这种保守的结构特征使TIC复合物与马达模块紧密接近，从而在前体蛋白易位的过程中，能够将前体蛋白从TIC复合物高效地传递给马达模块。

图7 Ycf2-FtsHi跨物种的保守性和多样性分析

为了深入了解Ycf2-FtsHi复合物的演化历程，研究人员通过蛋白质序列分析，表征了不同光合生物中Ycf2-FtsHi成分的存在情况。结果显示Ycf2-FtsHi成分主要存在于绿藻植物门中，而在红藻门中基本不存在。相反在红藻中，FtsHpt（FtsH的同源物）与Tic20pt（Tic20的同源物）可能共同承担起叶绿体蛋白质输入系统核心的重任。

结合前期莱茵衣藻TOC-TOC复合物的工作，该研究进一步揭示了叶绿体蛋白输入系统中马达蛋白的分子组成，绘制了一幅附着在叶绿体内外膜上的蛋白运输机器高速运转的景象。此外，通过结构和序列比对，为跨物种的叶绿体输入系统马达的保守性和多样性提供了进化上的新见解。

参考文献

Zeyu Jin, et al., Cell, 2022.

原文链接 

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00893-6

供稿 | 黄隽豪

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 

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