Cell | 从结构预测到精卵融合之谜，AlphaFold如何回答？

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对于有性生殖的生物而言，精子与卵子的融合是新生命诞生初期的关键步骤。尽管这一过程十分重要，人们对其机制的了解仍然十分局限。

人们关于脊椎动物配子相互作用的认知主要来源于对小鼠和斑马鱼的遗传学研究¹。在过去20多年里，研究者鉴定出了数种对于哺乳动物配子相互作用的关键蛋白，但只有精子IZUMO1与卵子JUNO之间的相互作用在生化和结构水平得到够证实²。当哺乳动物细胞表达外源IZUMO1时，能够与卵细胞上的JUNO结合²，但是两种细胞之间无法发生融合³，提示其中或许有其他关键的识别因子参与其中。

2024年10月17日，来自维也纳生物中心分子病理研究院 (Research Institute of Molecular Pathology, Vienna BioCenter) 的Andrea Pauli和Victoria E. Deneke共同通讯，在Cell上发表题为A conserved fertilization complex bridges sperm and egg in vertebrates的科研论文。通过使用AlphaFold-Multimer进行计算筛选，研究者发现Tmem81是鱼类和小鼠中一种重要的雄性生育因子，能与Izumo1和Spaca6相互作用。该三聚体蛋白复合物通过与哺乳动物中的JUNO或鱼类中的Bouncer结合，桥接了精子和卵子的细胞膜。Pauli课题组致力于揭示卵母细胞到胚胎转变这一重大发育过程中的新概念和分子机理，在这一过程中重点关注受精的调控机制以及卵子和胚胎发育过程中的休眠机制。

Izumo1、Spaca6、Dcst1和Dcst2是脊椎动物精子中四种已知且保守的生育因子，为鉴定这四种蛋白潜在的结合伙伴，研究者利用AlphaFold-Multimer对约1400种在斑马鱼睾丸中表达的分泌/跨膜蛋白进行了计算筛选 (图1A)，即对每个诱饵蛋白 (bait protein) 与候选蛋白 (candidate protein) 之间的蛋白-蛋白相互作用进行结构预测。与过去的研究相一致，Dcst1与Dcst2之间可以形成二聚体⁴，除此之外，两个高得分的预测结构引起了研究者的注意，即Izumo1-Spaca6和Izumo1-Tmem81 (图1B)。

Tmem81是一种在睾丸中表达的单跨膜蛋白，迄今为止尚未有研究发现其与受精相关。在系统发育上，其与Izumo1和Spaca6相关 (图1C)，三者在结构上具备相似的特征，具有一个免疫球蛋白 (Ig) 样结构域，通过一段柔性的linker与C端跨膜螺旋相连 (图1D)。

图1. 通过AlphaFold-Multimer筛选Izumo1、Spaca6、Dcst1和Dcst2的结合蛋白

鉴于Izumo1与Spaca6和Tmem81均能形成复合物，研究者进一步对这三个蛋白进行了结构预测，发现三者之间能够形成高置信度的复合物，且彼此之间存在相互作用 (图2E-G，E为斑马鱼中三聚体复合物的预测结构，G为小鼠中三聚体复合物的预测结构)。在预测模型中，互作界面呈现出电荷互补性和强保守性。基于以上结果，研究者提出假设，认为Tmem81可能是一种此前未知的重要的受精因子，通过一个保守的三聚体复合物在脊椎动物的受精过程中发挥作用。在后续的功能实验中，研究者通过免疫共沉淀和质谱对斑马鱼来源和人源蛋白复合物之间的相互作用进行了验证。

图2. AlphaFold-Multimer预测得到的Izumo1-Spaca6-Tmem81三聚体结构

通过CRISPR-Cas9，研究者生成了一系列斑马鱼和小鼠基因敲除品系。在斑马鱼中，tmem81、spaca6和izumo1基因敲除后的表型是相似的，在三个突变体中，雄性都是不育的，精子无法与卵子结合。Tmem81敲除小鼠和鱼的睾丸外观和重量正常，精子形态和运动能力正常。然而，基因敲除后的精子无法在体外受精实验中与完整的、无囊泡的卵子结合。尽管在基因敲除时，精子顶体反应发生后，IZUMO1能正常地发生重定位，并与卵膜结合，但后续的融合却无法发生 (图3E、3F)。结合其他一系列实验，研究者进一步确定了Tmem81是一个关键的雄性受精因子，对于脊椎动物中的精子-卵子相互作用至关重要。

图3. 小鼠Tmem81基因敲除后的精卵结合与膜融合

Bouncer是目前唯一一个已知的位于斑马鱼卵细胞上的生育因子，为了探究三元复合物对于精卵相互作用的影响，研究者进一步预测了Izumo1-Spaca6-Tmem81三聚体与Bouncer的复合物结构。Bouncer被预测能与先前的三元复合物存在高置信度的结合，三聚体尖端Izumo1的四股螺旋 (four-helix bundle, 4HB) 与Spaca6之间的空间形成了Bouncer的结合位点 (图4A)。

为验证Bouncer与精子三聚体之间的相互作用，研究者重组表达了单体BIR2-Bouncer (Bouncer融合拟南芥BIR2的LRR结构域以改善在昆虫细胞中的表达)，该重组蛋白能在斑马鱼中剂量依赖性地抑制体外受精地发生。通过免疫荧光染色，在Hela细胞中，同时过表达三聚体的细胞能够有效结合BIR2-Bouncer，而单独表达Spaca6或Izumo1的细胞则无法结合BIR2-Bouncer，提示三聚体或许能够作为Bouncer的受体发挥作用，从而在斑马鱼中介导精卵之间的相互作用。

Bouncer在哺乳动物中的同源蛋白SPACA4在睾丸中表达，在预测结构中，无法与三聚体产生相互作用。哺乳动物卵母细胞中的JUNO与IZUMO1的铰链区相结合，其结合位点与Bouncer显著不同 (图4E)。三聚体在脊椎动物精子中具有保守功能，通过与卵子上的不同配体相互作用，连接精子和卵子的膜。

综上，本研究通过结构预测和功能实验阐释了斑马鱼精子Izumo1-Spaca6-Tmem81复合体在受精过程中的作用，该复合体可能作为卵细胞上Bouncer的受体存在，从而连接精子和卵子的细胞膜，促进后续膜融合的发生。在哺乳动物中，该三聚体同样发挥重要作用，但与卵细胞上关键蛋白的结合位点可能存在差异。在哺乳动物中，卵细胞上JUNO与三聚体之间可能存在的相互作用或许能够回答与人类不孕或生殖相关的一些问题。

原文链接 

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.035

参考文献

参考文献

1. Okabe,M.(2018).Sperm-egginteractionandfertilization:Past,present,and future. Biol. Reprod. 99,134–146.

2. Aydin, H. (2016). Molecular architecture of the human sperm IZUMO1 and egg Juno fertilization complex. Nature, 534 (2016), pp. 562-565

3. Nishimura, K. (2016). The structure of sperm Izumo1 reveals unexpected similarities with Plasmodium invasion proteins. Curr. Biol., 26 (2016), pp. R661-R662

4. Noda, T. (2022). Sperm membrane proteins DCST1 and DCST2 are required for sperm-egg interaction in mice and fish. Commun. Biol., 5 (2022), p. 332

供稿 | 王彤彤

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 

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