The Innovation | 纳米孔测序技术：引领大数据时代下的基因组学与表观遗传学发展
导读
DNA和RNA测序技术的应用极大地促进了生命科学研究。当前，生物学研究已进入了基因组和后基因组时代。纳米孔测序技术因其具有超长的测序读长（超过2Mb）、测序速度快等优势已逐渐成为当今基因组学和表观遗传学研究的利器。本文阐述了纳米孔DNA测序和RNA测序的发展及其应用，总结了近年来该技术所取得的成果，并讨论了它们面临的挑战和未来的前景（图1）。
图1 图文摘要
纳米孔测序需要足够的灵敏度来识别DNA不同碱基的电流信号，由于DNA片段高速通过纳米孔，每个脉冲中含有5-6个碱基信号，给正确解码核酸序列带来了难度。近年来，深度神经网络被广泛应用于碱基识别算法的开发，包括卷积神经网络(CNN)、递归神经网络(RNN)和connectionist temporal classification (CTC)，大大提升了碱基识别准确率（从小于80%提高至98%以上）。
作为长片段测序平台的代表，纳米孔测序近期有望实现N50 > 100 kb的超长读取，更可直接实时测序RNA（DRS），获得mRNA全长序列，因而其比对算法与短读长的二代测序不同，新算法需处理超长读长和高测序错误。不同于利用“种子-扩展”算法的BLAST 和 LAST等传统比对软件，GraphMap、Minimap2、ReadUntil及UNCALLED等软件开发了多种比对策略，在运行速度、结果准确性及比对结果等方面上有了明显的提升。
基因组组装是基因组学的重要研究内容之一。得益于纳米孔技术的长读长测序，组装精度获得了显著提高。超长读长可以从头到尾的通读那些在短读长测序中无法测通的复杂基因区域。基于纳米孔测序的长读长基因组组装有两种策略，即“纠错后组装”和“组装后纠错”(图2)。例如，Falcon、Canu和NECAT采用了“纠错后组装”策略。相比之下，其他工具则采用“组装后纠错”的策略，如MiniASM、Flye、wtdbg2、Shasta、Smartdenovo和Raven。它们先将未校正的序列直接组装基因组，再对组装好的基因组进行校正。“纠错后组装”策略在纠错过程中通常需要花费大量的计算时间，因此总体速度比“组装后纠错”策略要慢。然而，直接组装未校正的序列会导致基因组某些复杂区域的错误。
图2 纳米孔测序两种基因组组装测序
类似地，纳米孔测序的长片段读长对基因组超长片段的直接测序，在解析基因组结构变异（SV）上具备绝佳的优势，甚至可以直接完成一些变异区域的完整覆盖。目前，研究人员基于纳米孔DNA测序(DDS)长读长的特性开发了几种检测SV的工具(图3)，并成功地应用于基础和临床研究中。
图3 纳米孔 DDS结构变异检测的原理流程图
除了长读长以外，纳米孔测序技术最大的特色是对RNA结构和核酸修饰的检测。纳米孔测序中，具有NAD帽子结构的RNA分子具备特异性的电离子信号，通过特定算法解析此类结构，同时分析具备此种结构的RNA分子在转录组中的分布。对于甲基化检测，可以首先构建特定甲基化修饰位点的训练数据，通过机器学习获取电离子信号特征，建立用于检测DNA和RNA修饰的探测模型，直接在测序信号中通过算法提取(图4)，从而在单碱基单分子水平检测甲基化的修饰。
图4 纳米孔测序技术甲基化检测技术流程
纳米孔测序在不同的研究领域被广泛应用，其设备的便携性和测序的高效性增加了该技术在临床基因检测和微生物基因检测中的场景适用性，但如何提高测序的准确度仍是需要不断攻克的难题。例如，高复杂性基因组区域依旧存在相对较高的碱基检测错误率，而此区域的检测是上述两类应用中亟需解决的关键。此外，临床基因检测中关注的低复杂性基因组区域，如串联重复序列、重复元件和MHC蛋白的变异位点和InDels，用纳米孔测序所得出的结论最好辅以不同实验技术来确保准确可靠。
总结和展望
纳米孔测序技术不仅代表了一种新的测序技术，而且极大地改变了我们在回答一些基本生物学问题方面的策略。例如，高质量的基因组有助于更容易找出不同物种间基因演化的关系，而对于天然核酸分子的表观修饰的直接探测所得到的表观遗传信息对于理解环境和基因互作所产生的表型的可塑性和物种对环境的适应性提供了直接和重要的实验支撑。随着纳米孔测序的进一步发展，以及不同领域的科学家加入，为解决碱基预测的准确度以及核酸修饰的精确度，更多难以攻克的疾病和农业生产上环境对作物产量影响的问题都会得到快速的解决。未来，纳米孔测序会持续给我们带来意外的惊喜。
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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(21)00078-3
本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第二卷第四期以Review发表的“Applications and potentials of nanopore sequencing in the (epi)genome and (epi)transcriptome era” (投稿: 2021-06-09；接收: 2021-07-16；在线刊出: 2021-08-10)。
DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2021.100153
引用格式：Xie S., Leung A., Zheng Z., Zhang D., Luo R., Luo M., Zhang S. (2021). Applications and potentials of nanopore sequencing in the (epi)genome and (epi)transcriptome era. The Innovation. 2(4),100153.
作者简介
张守栋，香港中文大学生命科学学院研究助理教授，主要从事植物表观遗传、运动生物大分子以及植物逆境生物学等的研究。较早运用纳米孔测序对植物内源RNA分子进行直接测序，同时参与设计基于纳米孔测序的NAD capped RNA分子鉴定。相关的成果发表在Nature、Nucleic Acids Research、Genome Biology、 PNAS、 Current Biology和Plant Physiology等刊物。
罗鸣，中国科学院青年创新促进会会员，青促会广州分会会长，生命分会秘书长，中国科学院华南植物园研究员。主要从事植物生长发育与非生物逆境胁迫表观遗传调控机制研究和药用植物组学大数据分析及次生代谢表观遗传调控机制研究。在Plant Cell、Molecular Plant、Trends in Genetics、Current Biology和PNAS等刊物发表论文40余篇，获得发明专利5项。
罗锐邦，香港大学工程学院计算机科学系助理教授，是生物资讯学与精准医疗系统方面专家。在Nature、 Nature Biotechnology、Nature Communications、Nature Machine Intelligence、Bioinformatics等刊物发表著作超50篇。总引用超万次。分别于2017年入选《福布斯》杂志“30位30岁以下亚洲人物榜”（Forbes 30 Under 30 Asia）生命科学榜，2019年获麻省理工科技评论选为亚洲35岁以下十大创新者，2019和2020年上榜科睿唯安跨领域研究者前1%。
肖传乐，生物信息学博士，广东省杰出青年基金获得者，中山大学中山眼科中心副研究员。长期致力于三代测序前沿计算方法开发及应用研究，近年来针对三代测序基因组学和表观遗传学的基础研究及应用中出现的计算瓶颈问题建立了系列关键算法和支撑软件。近五年以第一或通讯作者在Nature Methods、Molecular Cell、Nature Communications等发表40余篇高水平论文。.
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