The Innovation | 高通量解析复杂生物环境中蛋白质机器的三维结构

   导 读

在2017年冷冻电镜单颗粒技术基本成熟并获得诺贝尔化学奖之后，结构生物学家们利用单颗粒技术解析了大量的高分辨蛋白质结构。近年来人们逐渐认识到，大多数细胞功能的实现来自不同蛋白质机器的协同作用。因此，在细胞环境中进行结构研究是现阶段冷冻电镜技术的重要研究方向，这也被认为是结构生物学的下一个里程碑。

图1 图文摘要

目前，复杂生物环境中的结构解析主要是利用冷冻电子断层扫描重构技术（cryo-ET）。Cryo-ET需要将样品倾转序列角度并采集数据，进而计算重构出样品的三维结构，最终在重构的基础上运用亚单位平均技术（STA）提高三维结构的分辨率。但是倾转数据采集的通量非常低，要想解析得到较高分辨率，采集一套数据往往需要10天以上，这对于大部分电镜平台是难以承担的。其次，由于数据量的限制以及断层重构技术内源性的缺陷，基于断层重构的原位结构解析技术分辨率非常低。

上述缺点严重限制了冷冻电镜原位结构解析研究的开展。因此，针对处于复杂生物环境中的蛋白质分子，本文发展了新的结构解析方法，即利用单颗粒数据收集方法采集样品数据，并通过优化蛋白质探测算法和去除模型偏差，以获得目标蛋白质结构。该方法使得数据收集通量得到了显著提升，同时分辨率也得到了提高。

对处于复杂生物环境中的样品，目标蛋白在冷冻电镜图像中的密度与其它周围蛋白的密度重叠。本文将周围蛋白质的密度与低剂量成像导致的随机噪声一起作为噪声处理。然而，与随机噪声不同的是，来自周围蛋白质的密度是由蛋白质的结构因子决定的。因此，本文根据这一特点对探测函数的最优权重进行了推导。测试结果显示：与传统探测权重相比，优化权重后的探测函数显示出更高的探测效率（图2）。

图2 探测效率的提升

由于在计算中使用到了中频信号，这部分数据的信噪比往往偏低，因此会引入大量的假阳性结果，进而导致模型偏差，降低三维重构的分辨率。为解决这一问题，本文提出了一种排序算法，对每个参与重构的颗粒进行打分，然后根据分数对颗粒进行排序（图3），去除大量的低分颗粒，从而去除或者减轻了模型偏差的影响，提升了最终分辨率。成功去除模型偏差对重构的影响，意味着可以使用相似度较高的同源蛋白作为模型来解析未知的蛋白质原位结构。

图3 不同打分函数的分离效果

对此，本文中成功解析了一个非正二十面体对称病毒表面的糖蛋白结构以及羧酶体内部的Rubisco结构，相关冷冻电镜数据均在24小时内收集完成，说明本方法应用范围较广，且具有进行快速简单测定结构的潜力。

总结和展望  

本文基于蛋白质的识别初步开发了一种新型冷冻电镜原位结构解析技术。该技术可以在不收集电子断层数据的前提下实现目标蛋白质的高分辨结构重构，和传统的电子断层扫描成像方法相比，数据收集通量提升了10倍以上。

蛋白质结构的解析能力通常与其分子量大小及样品厚度密切相关，本文提出的算法可以避免冷冻电子断层技术所存在的种种弊端，基于厚度为100 nm以下的非切片样品即可解析出分子量大于400 kD的蛋白质高分辨结构。此外，主导探测函数的数据通常在1/20 Å^-1到1/8 Å^-1频率范围内（若像素大小为1 Å ，则等同于0.1~0.25 Nyquist），因此新一代的直接电子探测器、相位板等电镜硬件的发展还可进一步提升该方法的解析能力。

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(21)00091-6

本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第二卷第四期以Report发表的“Determining structures in a native environment using single-particle cryo-electron microscopy images” (投稿: 2021-01-13；接收: 2021-09-06；在线刊出: 2021-09-07)。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2021.100166

引用格式：Cheng J., Li B., Si L., et al. (2021). Determining structures in a native environment using single-particle cryo-electron microscopy images. The Innovation. 2(4),100166.

作者简介

章新政，研究员，博士生导师，中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室研究组长，国家重点研发计划首席科学家。主要研究方向包括：（1）发展冷冻电子显微学方法；（2）利用冷冻电子显微术研究重要蛋白质复合物的结构及功能；（3）利用冷冻电子显微术研究病毒的三维结构及病毒入侵、感染细胞以及抗体中和病毒的机制。已在Nature、Science、Cell、Nature microbiology、Nature plants、Nature communications等杂志上发表了20余篇文章。

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