The Innovation | 生物反应也讲究先来后到：DnaQ在CRISPR‒Cas系统中的作用

导 读

CRISPR‒Cas系统是原核生物的获得性免疫系统，其中Cas4负责完成PAM序列的移除和决定插入片段（Spacer）的正确方向。而在缺乏Cas4的系统中，DnaQ执行类似的功能。本文通过结构和功能研究，提出一个DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制：Spacer中含有PAM序列的一端延迟了DnaQ的酶切处理，所以另一端先发生整合反应，从而决定了Spacer的方向（图1）。

图1  DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制。含有PAM的DNA片段（携带行李的白色衣服乘客）经过安检门（DnaQ）时，需要将行李（PAM）托运，延迟了登机（整合）时间。不含PAM的DNA片段（不携带行李的黑色衣服乘客）先通过安检门，先一步登机，坐在靠里面的位置，从而决定了乘客的有序排列（Spacer在CRISPR阵列上的正确方向）。

CRISPR‒Cas系统是原核生物的获得性免疫系统，由CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）与Cas（CRISPR-associated proteins）两部分组成。CRISPR-Cas系统捕获入侵病毒的DNA片段并插入到自身基因组的CRISPR阵列中，称为Spacer。Spacer 的一侧带有PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。这些 Spacer被转录加工并与效应Cas蛋白形成复合物，靶向降解序列互补的外源DNA序列，从而消灭病毒、保护宿主细胞。

尽管不同的CRISPR-Cas系统之间存在着显著差异，但其Spacer获取阶段相对保守，都包含Cas1和Cas2蛋白，形成一个六元复合物，发挥整合酶功能，负责捕获合适的外源DNA片段并整合到CRISPR阵列之中，从而形成免疫记忆。为了发挥免疫识别和免疫清除功能，被整合进入CRISPR阵列的Spacer需要满足两个关键条件：1）正确的插入方向，保证对外源基因的正确识别；2）PAM序列在Spacer插入之前被移除，避免自身免疫的发生。

在含有Cas4的CRISPR‒Cas系统中，Cas4蛋白可以识别PAM，将捕获的外源DNA片段加工至合适的长度，并促进Spacer以正确的方向插入CRISPR阵列。而在缺乏Cas4的系统（~80% 细菌以及~15%古细菌）中，DnaQ家族的核酸外切酶来执行类似Cas4的功能，但具体机制仍不清楚。

本研究选择了一个独特的研究目标：嗜热链球菌的CRISPR-Cas系统。此系统中Cas2的C端融合了一个DnaQ结构域。研究者通过体内整合实验与深度测序，明确了DnaQ可以促进Spacer的高效获取，并确定了该系统的PAM序列。冷冻电镜（Cryo-EM）技术解析的Cas1-Cas2-prespacer复合物结构，阐明了Cas1识别PAM序列的分子机制。

图2 Cas1-Cas2-prespacer复合物的冷冻电镜结构以及不同菌种的比较

体外酶切结果表明，DnaQ能够将含有PAM和不含PAM的DNA链加工成标准长度进行整合反应，这也是首次证实DnaQ可以在体外切除PAM序列 （图3A）。同时，DnaQ对不含PAM的DNA链的加工效率明显高于含有PAM的DNA链（图3A）。体外整合实验发现，在PAM序列存在的情况下，DnaQ可以保证Spacer以正确的方向插入到CRISPR阵列中（图3C）。

图3  DnaQ依赖于PAM序列的酶切与Spacer整合机制

本文解析了嗜热链球菌的DnaQ、DnaQ-TMP复合物的晶体结构（分辨率为1.50 Å 和1.45 Å，图4），这是首个Cas相关DnaQ的高分率结构。基于结构信息，本文提出了DnaQ的催化机制。

图4  DnaQ和DnaQ-TMP复合物的晶体结构

综合上述研究结果，本文首次提出了一个DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制（图5）：DnaQ对于含有PAM一端DNA的酶切速度明显慢于不含PAM序列的一端，而先被处理至合适长度的一端以“先到先得”的方式先被整合到CRISPR阵列中，从而保证了Spacer插入的正确方向。本文阐明了在缺乏Cas4的CRISPR‒Cas系统中，DnaQ移除PAM序列以及决定外源 DNA 片段整合方向的分子机制。

图5  DnaQ（绿色）介导的“时间依赖”的Spacer整合机制

总结与展望

本文将嗜热链球菌的CRISPR‒Cas系统作为研究对象，利用体内体外整合实验、深度测序和生物信息分析、晶体结构和冷冻电镜技术等多学科手段，阐明了DnaQ在CRISPR‒Cas系统中的调控作用和分子机制。同时首次报道了Cas相关的DnaQ高分率结构，并为DnaQ移除PAM序列提供了直接的实验证据；提出由DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制为基于CRISPR-Cas系统Spacer整合的应用（如DNA信息存储器，疾病诊断和环境监测等）发展提供了理论基础。

责任编辑

黄   适     香港大学

韩永明     北京化工大学 

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(23)00123-6

本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第四卷第五期以Report发表的“DnaQ mediates directional spacer acquisition in the CRISPR-Cas system by a time-dependent mechanism” (投稿: 2023-04-10；接收: 2023-08-06；在线刊出: 2023-08-09)。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2023.100495

引用格式：Tang D., Jia T., Luo Y., et al. (2023). DnaQ mediates directional spacer acquisition in the CRISPR-Cas system by a time-dependent mechanism. The Innovation. 4(5),100495.

作者简介

陈 强，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室研究员，博士生导师。北京大学学士，北京大学博士，哈佛大学博士后，现任四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室结构生物学与分子信号转导研究室主任。研究方向为生物信号转导机制、微生物免疫系统的分子机制。2015年以来，以通讯作者身份在Mol Cell，Nat Struct Mol Biol.，Nat Commun.，Sci Adv.， Nucleic Acids Res.，Cancer Res.等期刊发表(或接受)研究论文25篇。

余雅梅，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室副研究员，博士生导师。四川大学学士，北京大学博士，哈佛大学博士后。主要研究方向为细菌免疫系统的工作机理，近五年以第一或通讯作者身份，在Nat Struct Mol Biol.，Mol Cell，Sci Adv.，Nat Commun.，Nucleic Acids Res.等期刊发表(或接受)论文17篇。

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