干货：精准Western blot 之组蛋白修饰Western blot

众所周知，组蛋白作为核小体的基本组成单位可以分为H1/H2A/H2B/H3/H4五种。事实上，组蛋白家族异常庞大远不止这五种，因为每种组蛋白都有对应的各种变体，少则两三个，多则七八个甚至十几个。核小体组装最终形成染色质的高级结构，染色质分为常染色质和异染色质。常染色质和异染色质之间的动态变化反映了细胞内时时刻刻进行的基因表达与沉默的过程，不论动物还是植物，只要是有遗传物质的生命体，体内每时每刻都在上演着常染色质和异染色质之间的领地争夺战。因此研究染色质的动力学变化过程对于理解细胞内基因表达的调控具有非常重要的意义。

啰唆了这么多，回到正题，那就是为什么要做组蛋白的Western blot？前面提到染色质的动力学变化与基因表达有关，那么跟组蛋白有什么关系呢？

答案就在这里，那就是组蛋白特定位点的修饰，如甲基化、乙酰化、磷酸化等等，这些位点的修饰会决定染色质的分类。举个简单例子，某个位点本来是异染色质，这个位点的基因是关闭的。而假如这个位点乙酰化变多，那么这个位点有可能就转为了常染色质，从而启动基因激活。因此研究染色质的动力学变化就最终简单到研究组蛋白修饰的问题，而解决方案之一就是通过Western blot研究组蛋白修饰。

目前大多数科研新手多采用裂解法提取细胞总蛋白来进行Western blot，这种方法虽然简单但是蛋白种类繁杂，不能很好的反应细胞组蛋白的变化，因此经过小编查阅文献，参考各种实验方案及实验室经验的传承，总结了以下提取高纯度组蛋白的方法—HCL/TCA法抽提组蛋白，希望对各位有所裨益。

具体实验protocol：

一、HCL抽提

1.收集细胞，并用PBS洗一次。

2.用TEB-Triton Extraction Buffer(TEB: PBS containing 0.5% TritonX-100 (v/v), 2mMphenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.02% (w/v) NaN3)以107 cells/mL的量重悬细胞。

3.冰上裂解细胞10-15 min，期间不时轻柔颠倒混匀。

4.6500 g，4 ℃离心10 min，分离核，弃上清。

5.用1/2体积的TEB再次悬浮沉淀（即细胞核），冰上裂解10-15 min，期间不时轻柔颠倒混匀。6500 g，4 ℃离心10 min。

6.弃上清后用0.2 N HCL重悬沉淀，4×107 nuclei/mL。

7.酸萃取组蛋白4 ℃过夜，建议在旋转仪上萃取过夜。

8.6500 g，4 ℃离心10 min，弃沉淀，取上清。

二、TCA沉淀酸中的组蛋白

1.转移上一步骤中收集的上清至新的1.5 mL EP管中，加入终浓度为33%的TCA，加入TCA时，应一滴一滴地加入，此时溶液出现乳白色沉淀。

2.冰上孵育30 min或4 ℃过夜。

3.16000 g，4 ℃离心10 min，弃上清（小心除去）。

4.加入500 μL丙酮（去除溶液中的酸），轻轻加入，避免重悬沉淀。

5.16000 g，4 ℃离心5 min，弃丙酮。

6.重复第4、5步。

7.在通风橱中干燥Histone , 20 min后，加入200 μL ddH2O溶解，分装后-20℃保存。

Tips:

1.收集的细胞如果不立即进行实验建议放-80 ℃保存。

2.提完组蛋白后建议在2-3周内完成实验，时间太长组蛋白修饰可能会丢失，影响实验准确性。

3.TEB buffer里面要加入蛋白酶抑制剂PMSF或者cocktail.

4.提完组蛋白可以先跑SDS-PAGE凝胶后进行考马斯亮蓝染色，确认组蛋白纯度和完整度（如下图所示）。

“路漫漫其修远兮，吾将上下而求索”，作为科研工蜂的座右铭再合适不过了。今天小编就写到这里，祝大家实验顺利，天天出Data.

1 Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D. & Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nature protocols 2, 1445-1457, doi:10.1038/nprot.2007.202 (2007).

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