胞内菌概念可能限制了我们的想象力

2020年，约翰霍普金斯公共卫生中心在Mol. Microbiol上发表“The intracellular pathogen concept”一文，对科学家们用了一个世纪的胞内菌概念提出了质疑。胞内菌的定义是否正确？胞内菌与胞外菌之间是否有严格的界限？胞内病原现有的矛盾点在哪里？john hopkins公共卫生研究团队给我们带来了新的观点。

胞内病原概念的由来与展望

顾名思义，胞内病原(Intracellular pathogen)根据微生物是否入侵宿主细胞、在细胞内部特定位置的定植与增殖习性，对病原加以区分。此概念也是现代细胞学、分子微生物学建立、发展的根基理论之一。在胞内菌概念的指导下，人类收获了一系列丰硕的微生物学、细胞免疫学发现成果。然而，随着知识的丰富和发展，作为一个上世纪中叶就发展出的学术概念，胞内菌概念已显得过于简单、粗暴。

胞内，还是胞外？这一界限日渐模糊，越来越多的证据表明，病原可以同时拥有胞内与胞外两种不一样的“人生轨迹”（Life-cycle）。尽管胞内菌对于临床诊断、基础研究的指导价值仍在，但由于人类致病性微生物致病过程中涉及一系列复杂、动态的网络化调控机制、宿主-病原表现出多变的相互作用方式，显然已不适用于胞内或者胞外“一刀切”式的分类。

图1.病原胞内营生各显神通图相关通路汇总.

（虚线左右分为胞浆菌与囊膜内菌）

(1). 土拉热杆菌（Francisella tularensis）——经吞噬后，从次级内体(Late endosome)样囊泡逃逸，而后在胞浆中增殖，然后可能转移至自噬溶酶体（Autolysosome）样内膜结构中。

(2). 单增李斯特（Listeria monocytogenes）——从吞噬溶酶体逃逸，进入胞浆并快速增殖，操控肌动蛋白聚合机制获得细胞间穿行能力。

(3). 类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）同样利用肌动蛋白移动，但通过诱导宿主细胞融合实现胞间传播。

(4). 贝纳柯克斯体（Coxiella burnetii）在吞噬溶酶体中存活，募集自噬标记蛋白LC3诱发胞内囊膜结构并在其中增殖。

(5). 结核分枝杆菌——在初级内体形成阶段就阻断吞噬小体继续成熟，并存活其中。

(6). 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)从初级内体诱导，内质网膜囊结构与粗面内质网囊泡行程，存活其中。

(7). 肺炎支原体（Chlamydia. pneumoniae）特异性募集高尔基体膜来源的囊泡内涵体，存活其中，在内涵体外周还招募肌动蛋白纤维进行进一步包裹。

(8). 肠沙门（Samonnella enterica）在次级内体中复制，以躲避溶酶体酶类降解。

胞内病原概念的重要预设条件是：能在胞内增殖营生的微生物在生物学和致病机制层面与“胞外”微生物完全不同，在此基础上，进一步将胞内微生物还区分为严格或兼性两类。此分类方法的潜在弊端是忽视了能进入胞内，但还未能证明是否可以增殖营生，即不能证伪性。

概念限制了我们的想象力?

某些所谓的胞外微生物，例如，金葡是“常识性”胞外菌，但具有胞内的生命史；反之，结核分枝杆菌（Tuberculosis mycobacteria）作为经典胞内菌，主要的研究都聚焦在巨噬细胞内的增殖与慢性感染的关系，从而忽视了游离的胞外分枝杆菌对人体致病作用。

图2. 肿瘤内细菌的细胞内定位（B）乳腺肿瘤细胞；(C) CD45+/CD68-免疫细胞；(D) 黑色素瘤巨嗜细胞内定位，癌旁组织设为阴性对照；(E) 电镜对乳腺癌细胞内细菌的观察。

Science刊出最新研究发现肿瘤组织中细菌大部分定位于癌细胞或免疫细胞内（图2）。分离利用FISH对16S rRNA进行标记、荧光抗体标记菌体成分磷壁酸与脂多糖，利用电镜直接观察印证胞内菌的亚细胞定位于核膜外周空间。16S 原位杂交结果呈弥散状，鲜见球、棒样典型的菌体形状，提示胞内菌可能为细胞壁缺陷型状态下L-型细菌。细菌胞内定位机制与生物学意义还不十分清楚，可能与细胞免疫应答、自由基氧化代谢有关。

胞内或胞外菌的定义，同时也把一些研究带进了死胡同。人结核杆菌深藏于胞内难以刺激机体免疫建立抗体介导的免疫应答，低效的免疫应答造成一种误解——过分强调细胞免疫抗TB感染的作用，而忽视了抗体的作用。近期有研究发现，抗体在TB宿主免疫中有重要作用。反之亦然，即便对于一些胞外菌，体液与细胞免疫具有相互增益的协同作用。

思想一旦受到惯性的禁锢，如某种微生物被贴上“胞外”抑或“胞内”的标签，就很难获得解放。含混、模糊的概念沿用至今，各个学研领域都竭力为金葡、耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）常见且重要的病原菌贴标签，然而事与愿违。举个例子，90年代末期，新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是公认的胞外菌，根据噬菌体荚膜结构常见于胞外。即使有人观察到胞内新隐，也被忽视为细胞消化过的死菌。后来无论在体内、体外都观察到隐球菌具有增殖活性，经过证据的长时间“教育”，隐球菌具有胞内活性才被广泛接受。无独有偶，直到发现埃里克体(Ehrlichiae)对体液免疫敏感，才打破了埃里克体属于严格胞内寄生菌的固有认知。

表1.几种能在胞内增殖的经典胞外菌

过去，胞内菌作为一个重要科学概念的提出，对细菌致病机制科学研究的影响和价值是不容质疑的。首先，推动了免疫学与微生物学向亚细胞结构水平的深入，研究者了解微生物如何吸附、进入细胞，如何从细胞逃逸，或者将宿主细胞当作“特洛伊木马”加以利用，迂回绕过表皮细胞屏障防线，进一步在组织中扩散。同时，促进研究者对胞内定植特性与宿主细胞代谢、免疫、细胞生物学与临床治疗实践的深入思考。就像任何法则都有适用情景，过分刚性地强调胞内还是胞外，就容易忽视一些不典型、非常规的生态位、隐匿生活史阶段（比如胞外）的重要性，比如，微生物基因组并不仅限于完整菌体基因组一种形式、也可能存在宿主加工、降解或修饰过的形式。非黑即白的划分已不适用于当下探索微生物与宿主细胞的关系、深入讨论病原菌致病机制、预防和诊疗应该综合考虑。

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参考文献

1. Casadevall A, Fang FC. The intracellular pathogen concept. Mol Microbiol. 2020;113:541545.

2. Nejman et al., The human tumor microbiome is composed of tumor type–specific intracellular bacteria. Science. 2020; 368, 973–980.