铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊断的进展和困境

浙江大学医学院附属第一医院呼吸与危重症医学科 杨麟，周华

【摘要】  

铜绿假单胞菌是下呼吸道感染常见致病菌，特别是医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎以及结构性肺病患者。铜绿假单胞菌下呼吸道感染的精准诊断是合理抗菌治疗、改善临床预后、减少医疗支出的关键环节。本文重点讨论铜绿假单胞菌下呼吸道感染临床诊断和病原学诊断的进展、问题，并对诊断方法的发展加以展望。

一、铜绿假单胞菌下呼吸道感染概述

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种下呼吸道感染常见的革兰氏阴性杆菌。PA可形成生物被膜，具有易定植的特征，结构性肺病如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、肺囊性纤维化患者是PA定植或感染的高危人群。在我国，医院获得性肺炎（HAP）病原谱中PA占比16.9%～22.0%，居第2位^[1]。PA也是重症病房感染最常见的病原菌，特别是呼吸机相关性肺炎（VAP）中PA感染率高，感染相关的危险因素包括年龄、疾病的严重程度和合并疾病等^[2]。PA导致的社区获得性肺炎（CAP）较少见，中国为1.0%左右，但PA可导致重症CAP，死亡率高达61%^[3]。

急性PA下呼吸道感染的危险因素包括：既往有下呼吸道PA分离史、结构性肺病、免疫抑制宿主、90天内全身抗菌药物使用史、接受有创检查或治疗、在PA流行区获得的感染。PA下呼吸道感染的临床表现、肺部影像学表现、实验室检查无特异性，PA下呼吸道感染的确诊依赖于病原学检测结果。

PA急性下呼吸道感染诊断标准为：有急性感染高危因素，符合肺炎、气管支气管炎、肺脓肿、脓胸的诊断，同期合格的下呼吸道标本分离到PA。慢性PA下呼吸道感染的危险因素主要包括：结构性肺病、长期接受免疫抑制剂或糖皮质激素治疗、反复接受全身广谱抗菌药物治疗。高危人群1年内从合格的下呼吸道标本中分离出PA≥2次（至少间隔3个月），并有感染相应的临床表现，影像学出现持续性、新发或加重的肺部渗出、浸润、实变即可诊断PA下呼吸道慢性感染。

二、铜绿假单胞菌下呼吸道感染的病原学诊断进展

痰、支气管抽吸物（endotracheal aspiration，ETA）、支气管肺泡灌洗液（BALF)、防污染毛刷( protected specimen brush，PSB）、胸腔积液、血液、肺组织等是常见的下呼吸道感染病原学诊断标本。痰标本易获取、成本低，但合格率仅为33.9%^[4]；采集不规范、标本量不足、储存运输不当是导致假阳性和假阴性率较高的重要因素。痰标本易受上呼吸道菌群污染，ETA、BALF、PSB等由于采样时可直接到达下呼吸道感染部位，敏感性和特异性相对较高，有益于早期诊断。胸腔积液和血培养在PA下呼吸道感染患者中特异性较高，危重症患者应在抗菌药物使用前尽快完成胸腔积液和/或血培养标本采集。肺组织标本获取相对复杂和困难，不是病原学诊断的首选标本；对不能排除感染的患者，在获取肺组织标本时不应仅进行病理学诊断，利用肺组织进行病原微生物诊断易被忽视但至关重要。

利用合格呼吸道标本进行涂片和培养是最常用的铜绿假单胞菌的检测方法，抗原或抗体检测、核酸检测等方法也不断得到发展并用于临床。抗原检测是用PA抗体检测体内有无PA抗原，主要有乳胶凝集试验、直接荧光抗体试验等，特异性高，但检测结果易受抗菌药物使用的影响。抗PA抗体在感染初期阳性率低，诊断抗体的检测无法实现PA感染的病原学快速检测。PA是唯一产生绿脓素（pyocyanin，PYO）的细菌，PYO有氧化还原活性，通过电化学方法可检测到纳米量级的PYO，样品无需预处理、操作简单，灵敏度高，可大规模应用于临床^[5]。电子鼻技术可检测PA代谢产生的挥发性有机物质（volatile organic compounds，VOC），操作简单，但灵敏度和稳定性还需提升^[6]。核酸扩增技术（NAAT）的发展则显著提高了下呼吸道感染病原体检测的灵敏度。聚合酶链式反应（PCR）技术可直接对菌种进行鉴定，特异性高，灵敏度强，耗时短。多重实时荧光定量PCR（MRT-PCR）可实现单一体系中多种病原体的检测，但由于不同引物扩增效率不同，可能出现假阴性。基因芯片技术则是将寡核苷酸片段固定在特定的材料上，检测样品中的靶序列，操作便捷，已实现商品化^[7]。NAAT的共同缺点是不能区分活菌与死菌，扩增过程可能出现碱基错配而影响最终结果。

基于高通量测序技术的宏基因组二代测序（mNGS）为感染性疾病的诊断带来了突破性进展，mNGS理论上可检测样本中的全部微生物，还可获取耐药突变、进化水平等关键信息，对危重患者、免疫抑制患者或初始治疗失败的患者有重要的诊断和鉴别价值^[8]。但mNGS易受环境微生物、工程菌、检测平台质控水平等因素的影响，需专业的生物信息学人员进行分析，测序成本较高，广泛的临床应用有一定限制。

总而言之，采集合适的临床标本，选择合适的诊断方式，必要时进行多种检测手段联合诊断，可以更加快速地完成PA的病原学诊断。

三、铜绿假单胞菌下呼吸道感染的药敏诊断进展

多重耐药（MDR）PA导致的下呼吸道感染与更高的病死率有关^[9]，早期识别耐药PA对降低病死率、缩短住院时间和医疗费用至关重要。PA耐药机制复杂，主要包括外膜通透性下降，主动外排系统过表达、产生灭活酶、靶位点改变、生物被膜形成等^[10]。现有的抗菌药物敏感试验（antimicrobial susceptibility testing，AST）包括表型AST和基因型AST，前者观察细菌在含药培养基上的生长情况，后者直接检测耐药基因。传统的表型AST主要有肉汤稀释法、K-B纸片扩散法、E-test法等。肉汤稀释法可精确测量最小抑菌浓度（MIC），但操作繁琐。K-B纸片扩散法应用广泛，操作简单，但抑菌圈大小无法精确对应具体MIC数值。E-test法结合稀释法与扩散法，操作便捷且可得出具体MIC数值，但费用较高。联合药敏试验可基于K-B法或肉汤稀释法开展，可观察2种或多种抗菌药物联合使用是否有协同或相加作用，对广泛耐药PA（XDR-PA）感染的治疗具有指导价值。

碳青霉烯类抗生素耐药PA所致感染的抗感染方案的选择困难，因此也最受关注。针对PA产碳青霉烯酶表型或基因型的检测取得进展。目前革兰氏阴性菌产生的碳青霉烯酶主要为A类丝氨酸酶（如KPC），B类金属酶（如IMP、VIM、NDM），D类丝氨酸酶（如OXA-48、OXA-23）。Carba NP试验是临床广泛使用的碳青霉烯酶检测方法，原理为碳青霉烯酶水解亚胺培南后溶液pH改变而发生颜色变化，其检测产碳青霉烯酶PA的灵敏度和特异度均>90%^[11]，但结果受检测溶液pH、培养基类型、接种量、孵育时间等多种因素影响。改良Hodge试验（modified Hodge test，MHT）原理是通过引入大肠埃希菌作为指示菌，碳青霉烯类抗菌药物被灭活后可观察到指示菌在其抑菌环与试验菌株接种线相交处生长，对Ａ类和D类碳青霉烯酶有较高敏感性。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）采用质谱技术，可通过检测PA特异性蛋白实现菌种鉴定，还可通过检测培养基中碳青霉烯类药物结构的完整性检测PA耐药性，对A类和B类碳青霉烯酶有很高的检测能力^[12]，但检测设备昂贵，尚不能大规模用于临床。

以实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）为基础的检测方法可直接检测耐药基因，也可通过检测不同药物浓度下目的基因扩增推断该抗菌药物浓度是否有效，还可通过逆转录PCR检测不同药物浓度下目的基因转录水平评估细菌的耐药性。qPCR检测速度快，但耐药表型可能涉及多种基因突变及表达，仅检测单一耐药基因可能无法准确预测耐药表型。商业化PCR检测试剂盒Xpert Carba-R检测KPC、NDM、VIM的灵敏度高。商业化微阵列试剂盒（bioFire filmArray，Verigene等）可实现更多耐药基因检测。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）被认为是检测碳青霉烯酶类抗生素耐药相关基因的最全面的分子检测方法，还可绘制横向和纵向的流行和传播图谱，监测PA的流行和爆发^[13]。三代测序技术，主要包括单分子荧光测序（single molecule real time，SMRT）和纳米孔（Nanopore）测序等^[14]，无需PCR扩增，通过对DNA/RNA分子单独测序，避免了扩增过程中碱基错配。特别是Nanopore测序，装置便携、测序读长长、检测耗时短，可同时进行菌株鉴定和耐药基因分析^[15]，有望广泛用于临床病原诊断和耐药基因的快速检测。

有研究发现一些PA克隆株（如ST235、ST111和ST175）在世界范围内广泛分布，与耐药表型有关，被称为PA高风险克隆株，PA高风险克隆株可在一定程度上代表MDR的存在，多位点序列分析（multi-locus sequence typing，MLST）通过对等位基因进行多样性分析识别高危克隆株，是目前用于检测高风险克隆株的金标准。其他技术如多位点数目可变串联重复序列分析（multiple locus VNTRs analysis，MLVA）、双位点分型（double locus sequence typing，DLST）也可用于克隆株的识别^[16]。我国近期发现的碳青霉烯类抗生素耐药的PA克隆株ST463常携带KPC基因且具有较高毒力，值得引起重视^[17]。监测高风险克隆株在特定区域内的流行和传播有利于早期对患者进行针对性的抗菌药物治疗，降低死亡率，同时加快疫苗研发和单克隆抗体制备以应对日益严峻的PA耐药问题。

分子生物学技术的发展帮助我们更高效地检测耐药PA，但对耐药基因的检测结果需谨慎解读，耐药基因阴性并不一定代表对相应抗菌药物敏感，因为还可能存在其他耐药机制；而即使耐药基因阳性也不完全代表相应抗菌药物无效，耐药表型还与耐药基因的表达等因素有关。目前情况下，临床抗菌药物选择仍需结合体外药敏试验进行综合评估。

四、展望和挑战

无论是传统微生物学实验、商业化检测平台还是新兴的分子生物学诊断方法几乎都可以独立完成PA的病原学诊断和耐药检测，但如何使检测更加高效、便捷、经济，仍是未来研究的难点。此外，现有的药敏试验大都是体外试验，是否可以直接通过检测患者标本（如血液、诱导痰、尿液、呼出气等）中PA感染相关的特异性生物标志物来评估急性感染者抗菌药物的有效性，预测慢性感染者的加重风险，也可能是未来研究的方向。与此同时，加快mNGS技术平台建设和基因组序列数据库的扩展，可协助构建PA毒力因子、生物被膜、耐药基因相互作用的复杂调控网络，也能提高临床医师对PA下呼吸道感染的认识，帮助预测PA的流行和传播，加快抗菌药物和疫苗研发，为个体化治疗提供新思路。

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